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1、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验一实验原理一实验原理1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定 pH 条件下， 不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动 方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的 pH 值、溶液的离子强度和电渗现象。 3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。 4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜 电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸
2、附现象等优点。 5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如： 丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜 具有均一的泡沫状的结构，厚度约为 120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋 白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电 点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 pH8.6 的缓冲体系中电泳，染色后可显示 5 条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依 次为 1-、2
3、-、-及 -球蛋白。二实验仪器和试剂二实验仪器和试剂 器材器材醋酸纤维素薄膜（38cm） ，培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子材料材料 新鲜血清（未溶血） 试剂试剂1、巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度 0.06）：巴比妥 1.66g, 巴比妥钠 12.76g，加水至 1000ml。置 4冰箱保存，备用。 （已配置）2、染色液染色液：氨基黑 10B 0.5g, 甲醇 50ml, 冰醋酸 10ml，蒸馏 水 40ml，混匀。3、漂洗液漂洗液：含 95乙醇 45ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水 50ml，混匀。4、NaOH 溶液：称取 NaOH 16g，定容至 1000ml。三
4、实验过程三实验过程一一.准备与点样准备与点样1.将薄膜剪成 38cm 的小条，在薄膜无光泽面距一端 1.5cm 处用铅笔轻轻划一条直 线，表示点样位置。2.将薄膜无光泽面向下，浸泡于 PH8.6 的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸 泡透。3.将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余水分。用毛细管吸取新鲜血清约 5ul，涂于厚 0.5 厘米的载玻片末端，然后轻轻压在划痕处，待血清完全浸入膜内以后移开载玻片。二、电泳二、电泳将点样后的薄膜置于电泳槽支架上，无光泽面朝下，点样末端置于负极。槽架上用四 层滤纸作桥垫，膜条与滤纸必须贴紧，平衡 5 分钟后通电，电压 110 伏，电泳 1 小时左右 关电源。三
5、、染色和漂洗三、染色和漂洗通电完毕后，用镊子将膜取出，直接浸于染色液中 2 分钟后取出，立即浸泡于漂洗液中， 反复漂洗，直至背景漂洗净为止。用滤纸吸干薄膜。四、定量（四、定量（洗脱法） 取 6 支试管，编号，每管加入 0.4mol/LNaOH4 毫升，剪下薄膜 上各条蛋白色带。另于 无色部分剪一大小与色带相仿的薄膜作空白对照。 将各条区带分别放入试管内，不时摇动，待蓝色完全脱下后。在波长 650nm 处比色。以 空白调零，分别读出各蛋白组分的光密度，然后计算出总光密度：光密度总和 T=清蛋清（A)+A1+A2+B+ r 各管的 0.D。各部分蛋白质的百分数为：清蛋白 A=A/T1 球蛋白= 1
6、/T 2 球蛋白= 2/T 球蛋白= /T 球蛋白= /T四注意事项四注意事项 保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上， 影响电泳结果。 注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡 10 分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之 不用。 加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋 白质区带图谱的完美。 电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。 电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约 0.4 0.6mA/cm,电压 110160V，通电时间 4060min。电压高，电流大，电泳速度加 快，时
7、间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。 使用比色皿时要润洗。 染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。 注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤 纸接触了。 通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。五、失败图谱的分析五、失败图谱的分析 拖尾状拖尾状 点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成 5 条区带或产生拖 尾。 有斑点有斑点 点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。 边流现象边流现象 点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流 现象。 区带模糊区带模糊 薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。 锯齿状锯
8、齿状 薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及 时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。 区带倾斜区带倾斜 薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点 样一边多一边少，区带容易泳斜。 显色过浅显色过浅 点样太少，区带显色不明显。 区带重叠区带重叠 染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固 定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 区带过密区带过密 电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。六、思考题六、思考题请你回忆一下你的实验过程，并圆满解释你的结果！本次实验对细节的要求较高，请大家务必耐心仔细，本次实验对细节的要求较高，请大家务必耐心仔细，预祝大家实验成功！预祝大家实验成功！_
