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1、生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定一、实验背景资料1该实验是高中阶段生物课程的第一个实验。从此以后生物化学方面的内容增加。本实验的操作技能的学习为以后该类型实验打好基础，一定要强调规范化操作方法。2低高倍镜的使用、徒手切片、临时装片等技能，学生经初三、高一两年的搁置，已显生疏。实验时教师可考虑予复习，或通过演示提醒学生，注意规范操作要领。3本实验难度并不大，但由于内容较多、实验时间长，必须作周密安排才能完成。如实验中教师应做好学生的分工合作可缩短实验时间。同时又能培养学生的合作精神。4.培养学生主动获取知识，应用知识分析现象，归纳总结的能力，培养学生实际操作的能力及从现象出发探求事物本质的能
2、力。5.通过亲手实验体验科学家严谨治学的科学态度，培养实事求是的世界观。6.实验内容较多，实验时间长，必须周密安排，才能按时完成。学生要分工合作、教师指导演示。二、实验原理1可溶性还原糖鉴定原理生物组织中普遍存在的可溶性糖类较多，有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。前三种糖的分子内都含有游离的具还原性的半缩醛羟基，因此叫做还原糖；蔗糖分子内没有，为非还原糖。 实验中所用的斐林试剂，只能鉴定生物组织中可溶性还原糖，而不能鉴定可溶性非还原糖。斐林试剂为一定浓度的氢氧化钠和硫酸铜配制而成的淡蓝色Cu(OH)2沉淀的悬浊液，葡萄糖溶液在加入斐林试剂后，在加热条件下还原为砖红色的沉淀，而葡萄糖氧化成葡萄糖酸。
3、其反应式为：苏丹红 IV 苏丹红 III CH2OH (CHOHH)4 CHO + 2Cu(OH)2 CH2OH (CHOH)4 COOH + Cu2O + 2H2O 用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液变化过程为；浅蓝色棕色砖红色沉淀2.脂肪鉴定原理苏丹 (苏丹 )为一种脂肪染色剂(易溶解于酒精， 不溶解于水 )。苏丹染液遇脂肪的颜色反应为橘黄色，苏丹染液遇脂肪的颜色反应为红色。其反应式为: 苏丹 (苏丹 )为一种脂肪染色剂(易溶解于酒精， 不溶解于水 )。苏丹染液遇脂肪的颜色反应为橘黄色，苏丹染液遇脂肪的颜色反应为红色。其反应式为: 橘黄色脂肪红色3.蛋白质鉴定原理鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，
4、常用双缩脲法， 使用的是双缩脲试剂。双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g mL 的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 g mL 的硫酸铜溶液。在碱性溶液 (NaOH) 中，双缩脲 (H2NOC NH CONH2) 能与 Cu2+ 作用，形成紫色或紫红色的络合物， 这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。三、实验器材及器具1.实验材料：（1）还原糖：在做可溶性还原糖的鉴定实验中，最理想的实验材料是含糖量较高的生物组织(或器官)，而且组织的颜色较浅，最好是白色或近于白色的植物组织，这样可以避免材料自身颜色对实验变化颜色的掩盖。
5、经实验比较， 颜色反应的明显程度依次为苹果、梨、白色甘蓝叶、白萝卜。故选用苹果作为实验材料。但要注意，苹果组织液必须临时制备，切勿保存时间过长。因为苹果多酚氧化酶含量较高，组织液很容易被氧化成褐色，将反应产生的颜色覆盖。温度高时，氧化的速度更快。而梨和白心萝卜的组织液不会有这种现象出现。双子叶植物光合作用的主要产物为淀粉，其叶不理想。有些单子叶植物，如韭菜、鸢尾等，其叶内含有大量的可溶性单糖，但由于叶片中叶绿素颜色较深，影响鉴定时实验现象的观察，也不宜作实验材料。（2）脂肪实验材料最好选用富含脂肪的种子，且徒手切片要成功，要求实验技能较高，不妨改成刮取花生子叶泥制作临时装片，易做，效果又好。（
6、3）蛋白质最好选用富含蛋白质的生物组织，植物材料常用的是大豆，动物材料常用的是鸡蛋，鉴定之前需要留出一部分样液，以便与鉴定后的样液的颜色做比较，这样可增强说服力。鸡蛋清：蒸馏水=1:9 混合均匀，再用4 层纱布过虑，放入滴瓶中备用，这样配制的蛋清溶液与双缩脲试剂反应后不会粘固在试管内壁上，反应也彻底，试管也容易洗刷干净。也可以用浓豆浆代替蛋清溶液。2.实验药品：（1）斐林试剂 : 甲液氢氧化钠的质量浓度0.1g/ml的溶液乙液硫酸铜的质量浓度0.05g/ml的溶液使用时临时配制，将4 滴 5 滴乙液滴入2ml 甲液中，配完立即使用。与斐林试剂原理一样的本尼迪试剂配制后可长久保存，配方如下：无水
7、硫酸铜1.74g 溶于100ml热水中冷却后加至150ml 。取柠檬酸钠173g ，无水碳酸钠100g和 600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml 。再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入即可。（2）苏丹 III 溶液的配制称取 0.1g 苏丹 III，溶于 50ml 丙酮中，再加入70 酒精 50ml 即可使用。（3）苏丹溶液的配制称取 0.1 g 苏丹干粉，溶于50 mL 丙酮中，再加入体积分数为70% 的酒精 50 mL ，充分混合后即可使用。（4）双缩脲试剂的配制：取 10g 氢氧化钠放入量筒中，加水至100ml ，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成氢氧化钠的质量浓度为0.1g/ml的溶
8、液，瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂A 取 1g 硫酸铜放入量筒中，加水至 100ml ，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成硫酸铜的质量浓度为 0.01g/ml的溶液（蓝色），瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂B 3.实验仪器：显微镜、双面刀片、试管、试管夹、大烧杯、酒精灯、三脚架、石棉网、试管架、载玻片、吸水纸、电炉。四、实验步骤1.还原糖的鉴定：1）制备生物组织样液（1）将洗净苹果切成小块。（2）取几小块（ 5g ）放入研钵中，加少许石英砂研磨，再加5ml 水，继续研磨。（3）将玻璃漏斗插入试管中，在漏斗上垫一层纱布，将研磨液过滤。2）实验操作方法和观察（1）取一支试管，向试管内注入2ml 苹果组织
9、液（ 2）向试管内注入2ml 刚配制的斐林试剂。振荡试管，使溶液混合均匀，此时溶液呈蓝色。（3）将这支试管放进盛有开水的大烧杯中，用酒精灯加热煮沸2 分钟左右。在对试管加热煮沸的过程中，随时仔细观察试管中溶液的颜色发生了什么变化。2.脂肪的鉴定（1）取一粒浸泡34 小时的花生种子，去皮后纵切下一些薄片（注意刀片不要划伤手指）（2）用毛笔将最薄的一片移到洁净的载玻片的正中央（3）向花生薄片上滴23 滴苏丹染液，染色23 分钟后用吸水纸吸去薄片周围的染液（染色的时间一定把握好）（4）在薄片上滴12 滴 50% 的酒精以洗去浮色，用吸水纸吸去周围的酒精（5）在薄片上滴12 滴蒸馏水，盖上盖玻片（盖玻
10、片不要平放，应倾斜一定的角度下放，以免产生气泡，若有气泡，可在一边滴蒸馏水另一边用吸水纸吸水至无气泡止）（6）用低倍镜寻找装片的最薄处（12 层）并将这部分移到视野的正中央，观察已着色的圆形小颗粒。（7）换用高倍镜观察（注意：在使用显微镜的过程中显微镜一定要平放不可倾斜）3.蛋白质的鉴定（1）制备黄豆组织样液教师用豆浆机，事先制成黄豆组织样液。（2）实验操作和观察向试管内注入黄豆组织样液2L。向试管中加入2L 双缩脲试剂A( 质量浓度为0.1g L1 的氢氧化钠溶液)，摇荡均匀。注意观察试管内溶液的颜色有什么变化。再向试管中加入34 滴双缩脲试剂B(质量浓度为0.01g L1 的硫酸铜溶液 )
11、，摇荡均匀。注意观察溶液的颜色有什么变化。五、替代实验的方法1.还原糖鉴定：多伦试剂法：多伦试剂即硝酸银氨水溶液，配制方法：取0.3ml2 硝酸银溶液，滴入10 氢氧化钠溶液，再滴入2氨水溶液，边滴边摇动试管，直到生成的沉淀恰好溶解，即得到澄清的硝酸银氨水溶液。现用现配。方法：在洁净试管中加入0.5ml2 糖溶液，再加入1ml 多伦试剂，摇匀后，室温下静置5 10 分钟，如果没有银镜反应或银析出，将试管放入50oC 水浴，观察现象（形成银镜） 。多伦试剂即硝酸银氨水溶液，配制方法： 取 0.3ml2 硝酸银溶液， 滴入 10 氢氧化钠溶液，再滴入 2氨水溶液，边滴边摇动试管，直到生成的沉淀恰好
12、溶解，即得到澄清的硝酸银氨水溶液。现用现配。2.探究实验（1） 给予实验任务现有一瓶“牛奶”，请学生用实验来探究牛奶中是否含有说明书中所说的糖、蛋白质、脂肪三类成份。（2）还原性糖实验实验原理：牛奶中的乳糖是一种醛糖（由葡萄糖+ 半乳糖构成），能还原斐林试剂（0.1% NaOH,5% CuSO4）中的 Cu2+ 产生砖红色Cu20 沉淀。实验步骤：取 2 块试管，编号水、牛奶；滴加 4 滴斐林试剂A 液，再滴加4 滴斐林试剂B 液，摇匀；再分滴加7 滴水、牛奶摇匀；同时用两个试管夹夹着在酒精灯上均匀加热30 秒；观察并记录现象（牛奶显现砖红色）。（3）脂肪实验实验原理：牛奶中的奶油和维生素D
13、等是含量丰富的脂类物质，它们可被苏丹染液染成橘红色颗粒。实验步骤：取过滤纸一片，等距编号：水、食用油、牛奶；分别滴加2 滴水、食用油、牛奶于相应处；分别滴加1 滴苏丹于3 处，染色3 分钟；观察并记录现象（水显红色；食用油、牛奶显橘黄色）。（4）蛋白质实验实验原理：牛奶中富含酶、磷蛋白等蛋白质，其中肽链中的-CO-NH-能在 NaOH溶液中与CuS04 稀溶液（ 1% ）产生紫色，因而证明蛋白质存在。实验步骤：取 2 支试管，编号。分别注入约1/8 试管水、牛奶；再分别注入1/8 试管双缩脲试剂A，摇匀；再分别向试管中加入34 滴双缩脲试剂B 液，摇匀；观察并记录现象。（牛奶显现紫色）（5）结
14、论：奶粉中确实存在还原糖、蛋白质、脂肪。六、思考题1.斐林试剂主要用来鉴定可溶性还原糖，其主要成分为NaOH 和 CuSO4 的混合液， 用你已有的化学知识判断，这两种物质混合以后能发生了什么化学反应?并解释为什么斐林试剂要现配现用，不能放置太久？2.斐林试剂中的什么成分在加热条件下与还原糖发生了什么化学反应?砖红色的沉淀物是什么? 3.为什么根据某些化学反应能够使生物组织中的有关有机物产生固定的颜色反应可以鉴定生物组织有糖、脂肪、蛋白质的存在? 4.什么样的糖属于还原性糖？举例说明。我们平时的主食如馒头、米饭中含有大量淀粉，淀粉是还原性糖吗？为什么？你怎样用实验证明的？对淀粉进行怎样的处理就
15、能发生斐林反应或银镜反应？七、注意事项1)(0.1g/mL的 NaOH溶液 )和乙液(0.05g/mL的 CuSO 溶液 )分别配制、储存，使用时，再临时配制，将45 滴乙液滴入2mL 甲液中，配完后立即使用。切勿将甲液和乙液分别加入组织样液中。(2) 鉴定可溶性还原糖，加热试管时，应该用试管夹夹住试管上部，放入盛开水的大烧杯加热； 注意试管底部不接触烧杯底部，同时试管口不要朝向实验者，以免试管内溶液沸腾时冲出试管， 造成烫伤。如果试管内溶液过于沸腾，可以提起试管夹，使试管与沸水接触面减少，以免溶液溢出。(3) 在鉴定脂肪的实验中，若用花生种子作实验材料，必须提前浸泡34 小时， 浸泡时间短了
16、， 不容易切片， 浸泡时间过长， 则组织太软， 切下的薄片不易成形，切片要尽可能的薄。(4) 染色后一定要用50% 的酒精溶液洗去浮色，染色和洗浮色时间不宜过长（否则酒精将脂肪溶解影响实验效果），观察时找最薄处最好只有1 2 层细胞。）(5)在蛋白质的鉴定实验中，若用蛋白质作实验材料，必须稀释，如果稀释不够，与双缩脲试剂发生反应后会粘固在试管内壁上，使反应不彻底，且试管不易洗刷干净。双缩脲试剂的使用，应先加试剂A(0.1g/mL的 NaOH溶液 )，造成碱性的反应环境，再加试剂 B(0.01g/mL的 CuSO 溶液 )。八、用品清单材料：苹果、花生、大豆试剂：苏丹III 粉末、苏丹IV 粉末、丙酮、酒精、氢氧化钠粉末、硫酸铜粉末、70% 酒精
