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1、1第 19 章支原体、衣原体、立克次体一、教学大纲要求（1）掌握肺炎支原体和解脲脲原体的生物学特性和微生物学检验。（2）掌握衣原体的生活周期，掌握沙眼衣原体的微生物学特性和微生物学检验，熟悉衣原体所致疾病。（3）掌握立克次体的生物学特性、所致疾病和微生物学检验。二、教材内容精要（一）支原体支原体（Mycoplasma）是一群介于细菌与病毒之间，能在人工培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物，支原体没有细胞壁，形态上呈高度多形性，可通过滤菌器。支原体因其缺乏细胞壁归属于柔膜体纲的支原体目。下分三个科：支原体科生长时需从外界环境摄取胆固醇；无胆甾原体科生长时不需外源性胆固醇；螺旋原体科虽生长需要
2、胆固醇，其特点是生长到一定阶段呈螺旋形。支原体科中又分支原体和脲原体二个属。支原体在自然界中分布十分广泛，对人致病的主要是肺炎支原体(Mycopasma pneumoniae，,MP)、解脲脲原体(U.urealyticum)。1肺炎支原体（1）生物学特性 1）形态与染色 肺炎支原体没有细胞壁，仅有细胞膜，呈高度多形性，常见形态为球形、杆形及长丝形，有时可见分枝与星状体。革兰染色阴性，但不易着色，常用姬姆萨染色，呈淡紫色。2）培养特性 对低渗透压敏感，营养要求高于一般细菌，需加入 20%马或小牛血清，多数支原体还需添加新鲜酵母浸液、组织液等。支原体繁殖较慢，在固体培养基上 35培养 23d，菌
3、落中央的核心部分较厚、向下长入培养基，周边由透明颗粒组成的薄薄的一层贴在琼脂表面，呈油煎蛋菌落。3）生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用葡萄糖、水解精氨酸来与其它致病支原体进行鉴别。4）抗原结构 支原体的抗原性主要来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是支原体的主要型特异性抗原，其抗原性常用生长抑制试验（growth inhibition test,GIT）与代谢抑制试验(metabolism inhibition test，MIT)鉴定。GIT 是将吸有型特异性抗血清的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长的现象。MIT 是将支原体接种在含有抗血清的葡萄糖（酚红）培养
4、基中，若抗体与支原体型相对应，则抑制该支原体分解葡萄糖，酚红不变色。此两种方法可将支原体分成若干血清型。5）抵抗力 4放置不超过 3 天，56很快灭活。对热、干燥非常敏感，冻干能长期保存。因支原体无细胞壁，对青霉素、头胞菌素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对脂溶剂、去垢剂和石炭酸、甲醛等常用消毒剂敏感。2（2）临床意义 肺炎支原体是非典型肺炎的病原体，主要侵犯呼吸系统。肺炎支原体黏附于黏膜上皮细胞的受体上，吸取宿主细胞的养料生长繁殖，同时释放有毒代谢产物如过氧化氢、核酸酶等使细胞受损。主要通过呼吸道传播，青少年易感，冬秋季较多见，引起间质性肺炎和急性支气管炎，占肺炎发病率的 15%20%，病理变
5、化以间质性肺炎为主。 （3）微生物检验1）检验程序 标本分离培养 直接镜检 PCR 查 DNA（含血清和酵母浸膏培养基） 37、5% CO2 12 周典型的菌落鉴定革兰染色不着色 生化反应 血清学试验 电镜观察无细胞壁图 肺炎支原体的检验程序2）标本采集 一般可取病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物等。因肺炎支原体有粘附细胞的作用，以拭子标本为好。支原体对热和干燥敏感，取材后应立即接种或置转运培养基中（蔗糖磷酸盐缓冲液） ，4能保存 72h，-70或液氮能长期保存。3）检验方法显微镜检查 革兰染色不易着色，电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。分离培养 常用的培养基以牛心消化液为基础另加 2
6、0%小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。在含 5%CO2大气环境下培养，初分离时，一般 10d 左右长出菌落，呈致密圆形，常不出现油煎蛋状，需经数次传代后，菌落开始典型。肺炎支原体的分离阳性率不高，对临床快速诊断意义不大，但对流行病学调查有重要意义。34）鉴别要点 支原体的鉴定 主要靠形态染色、菌落特征、生化反应及特异性生长试验等。支原体在固体培养基生长有陷入培养基生长的趋势，经 710d 培养可形成细小的菌落，观察时最好用低倍显微镜或倒置显微镜。支原体的菌落多为中心致密凸起，四周浅薄，呈典型的油煎蛋菌落。用 Diene 染色，支原体菌落中心为翠蓝色，边缘浅蓝色，且不易褪色，其它细菌
7、不着色。与细菌 L 型的区别 细菌 L 型也有多形性，也对低渗敏感，也可形成油煎蛋菌落，易与本菌混淆，但细菌 L 型在无抗生素等诱导因素作用下，可返祖为原菌，染色后易褪色，以此可鉴别。种间的鉴别 依据支原体对葡萄糖、精氨酸、尿素这三种物质利用情况不同可初步分类。肺炎支原体分解葡萄糖和精氨酸，在含葡萄糖的培养基上生长产酸，使酚红指示剂变黄，尿素试验阴性；解脲支原体不分解葡萄糖和精氨酸，尿素变红，尿素酶试验阳性；人型支原体分解精氨酸，不分解葡萄糖，在含精氨酸的培养基中可分解精氨酸产 NH3，使 PH 升高，酚红指示剂变红。5）核酸检测：PCR 法快速、敏感、特异，目前有些实验室用这一技术检测患者痰
8、中肺炎支原体DNA。由于此法相当敏感，故试验操作时应特别小心，避免污染。3解脲脲原体解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)也称溶脲脲原体，是 1954 年 Shepard 首先从非淋球菌尿道炎（NGU）患者的尿道分泌物中获得，因其菌落细小，故曾称为 T 支原体（T-mycoplasmas） 。按其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。解脲脲原体是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，它与人类的多种疾病有关。（1）生物学性状1）形态与染色 解脲脲原体呈高度多形性，常见形态为球形、杆形及长丝形。革兰染色阴性但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层薄膜构成，内、外两层由
9、蛋白质组成，中层为类脂质。2）培养特性 解脲脲原体营养要求很高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液，在液体选择培养基中 35培养 1824h，因分解尿素使培养基变成红色；在固体培养基上 35培养23d，形成细小（仅 1040m） 、周边较窄的油煎蛋样菌落（需用低倍显微镜观察） 。3）生化反应 不分解葡萄糖和精氨酸，但可利用尿素，放出氨气，能吸附豚鼠及绵羊红细胞，四氮唑还原试验阴性。4）抗原结构 解脲脲原体除脂多糖抗原和蛋白质抗原外，还有脲酶抗原，后者是解脲脲原体种特异抗原，可与其它支原体区别。解脲脲原体有 16 个血清型，其中以第 4 型引起疾病的频率最高。5）抵抗力 由于解脲
10、脲原体与其它支原体一样，无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂溶剂、清洁剂、酒精、特异抗体和补体溶解。对热抵抗力差，对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，常用4于治疗并能获效的主要是大环内脂类、四环素内、林可霉素类及喹诺酮类等抗生素。（2）临床意义 解脲脲原体主要引起人体泌尿生殖系统的感染，主要传播途径为性接触传播和母婴传播，其致病机制可能与其侵袭性酶和毒性产物有关，解脲脲原体吸附宿主细胞后，可产生磷脂酶分解细胞膜中的磷脂，影响宿主细胞生物合成。尿素酶分解尿素产生氨，对细胞有毒性作用。产生 IgA 蛋白酶，可降解 IgA1 形成 Fab 和 Fc，破坏泌尿生殖道粘膜表面 IgA 的局部抗感染作用
11、，有利于解脲脲原体粘附于泌尿生殖道粘膜的表面而致病。解脲脲原体所引起的疾病最常见的是非淋菌性尿道炎，还可致子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、围产期疾病及死亡，也可引起肾盂肾炎、阴道炎和盆腔炎。解脲脲原体与不育症的关系还有争论，已有资料表明解脲脲原体可吸附精子，影响精子的运动活力，使精子的代谢和功能受损（3）微生物检验1）检验程序 标本（尿道、阴道分泌物等） PCR、 DNA 探针技术 检测 DNA图 解脲脲原体的检验过程2）标本采集 用无菌棉拭子或无菌试管取非淋菌性尿道炎患者的尿道分泌物，慢性前列腺炎患者按摩后的前列腺液，原因不明不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等
12、。3）检验方法液体培养基（含有酚红和尿素）阳性（红色） 阴性（黄色）固体培养基典型的菌落鉴定生化反应血清学试验5核酸检测 以部分脲酶基因的核苷酸序列为模板，合成相应的引物经体外扩增后，解脲脲原体 16个血清型均见 460bp 的 DNA 片段。通过对 PCR 产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。该法敏感性高，但假阳性较高，故不适用于临床。ELISA 不仅可以测定血清型别，还可测出 Ig 的类型（IgM、IgG） ，较敏感，特异性强，有早期诊断意义。分离培养、鉴定及药物敏感试验 应用选择鉴别培养基对解脲脲原体进行分离，配合使用鉴定、计数和药敏试验板，可同时对解脲脲原体进行鉴定、计数
13、和多种抗生素的药敏测定，体外药敏实验有助于指导临床用药。将标本接种于含营养、尿素、精氨酸和酚红指示剂的培养基中（pH6.3） ，标本如有解脲脲原体存在，在 37培养 2448h,由于解脲脲原体生长，分解尿素或精氨酸，产氨使培养基变碱，pH上升至 7.68.6 左右，液体培养基颜色由橙黄色转变成红色可判定有解脲脲原体生长。解脲脲原体在液体中不出现菌膜，浑浊及沉淀生长现象，如培养基出现浑浊，表明有杂菌污染，不能报告解脲脲原体阳性。（二）衣原体衣原体是一类能通过滤菌器、严格细菌内寄生、有独特生活周期的原核细胞型生物。其共同特性：有 DNA 和 RNA 两种类型核酸。具有 LPS 和蛋白质所组成的细胞
14、壁。通过独特的生活周期，二分裂方式繁殖（类似细菌） 。有核糖体。有较为简单的酶系统，能进行一定的代谢活动。对许多广谱抗菌素敏感。衣原体属（Chlamydia）是衣原体科唯一的一个属，包括沙眼衣原体（C.trachomatis）、鹦鹉热衣原体（C.psittaci）、肺炎衣原体（C.pneumoniae）和猫心衣原体（C.pecorum）4 个种。衣原体在宿主细胞内生长繁殖，有独特的生活周期，以两种发育类型存在：原体（elementary body，EB）是衣原体胞外存在形式，圆形（直径 0.250.35m）,中央有一致密的拟核，有较致密而坚韧的细胞壁，是发育成熟的衣原体，Giemsa 染色呈紫
15、色，具有高度的感染性；网状体（reticulate body）或称始体（initial body，IB）,圆形（直径 0.51.0m）或不规则形，中央成纤细的网状结构，无致密拟核，Giemsa 染色呈兰色。始体为宿主细胞内的繁殖体，代谢活泼，不能在胞外存活，无感染性。原体与易感宿主细胞表面的特异受体吸附后，通过吞噬作用进入细胞内，形成吞噬小泡，阻止吞噬溶酶体融合。原体在泡内细胞壁变软，增大形成网状体，RNA 增多。大约 8h 后，始体二分裂增殖，在细胞膜包裹的空泡内聚集、扩增，即称为包涵体（inclusion bodies） 。于感染 1824h 后，网状体浓缩形成具有坚韧细胞壁的原体，最后细
16、胞破裂释放原体，再感染其他细胞，开始新的发育周期。每个发育周期约需 4872h。61沙眼衣原体沙眼衣原体又分为沙眼、性病淋巴肉芽肿和鼠型三种生物变种。前两种生物变种自然宿主都是人。分别感染眼、生殖道、呼吸道以及淋巴结，鼠型在鼠间传播。沙眼生物变种又可分为 12 个血清型（A-K） ，性病淋巴肉芽肿生物变种可分为 3 个血清型（L1-L3） 。（1）细菌特性1）形态与染色 沙眼衣原体的原体有较致密而坚韧的细胞壁，存在与细胞外，具有高度感染性。原体用 Giemsa 染色呈红色；始体（网状体）体积较大，呈深蓝色或暗红色。沙眼衣原体在宿主细胞的细胞质内形成包涵体，由密集的颗粒组成，Giemsa 染色呈深紫色，其基质中含有糖原，用碘液染色呈棕褐色斑块。2）培养特性HeLa-22
