寄生虫学实验诊断技术(1)

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1、第五篇实验技术第五篇实验技术第二十一章寄生虫学实验技术第二十一章寄生虫学实验技术第一节寄生虫学实验诊第一节寄生虫学实验诊 断技术断技术一、病原检查一、病原检查（一）粪便检查粪便检查是诊断寄生虫病常用的方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜， 送检时间一般不宜超过 24 小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查。盛粪 便的容器要干净，并防止污染与干燥；粪便不可混杂尿液等，以免影响检查结 果。1.直接涂片法 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续 作 3 次涂片，可提高检出率。蠕虫卵检查：滴一滴生理盐水于洁净的载玻片，用棉签棍或牙签挑取绿 豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度

2、以透过涂片约可辨认书 上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫 卵与粪便中异物的鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具 固有色泽；卵内含卵细胞或幼虫。原虫检查：1）活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温，滋养 体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水。 如碘液过多，可用吸水纸从盖片边缘吸去过多的液体。若同时需检查活滋养体， 可在用生理盐水涂匀的粪滴附近滴一滴碘液，取少许粪便在碘液中涂匀，再盖 上盖片（图 211）。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋养体。图 211

3、 原虫包囊碘液染色操作方法碘液配方：碘化钾 4g，碘 2g，蒸馏水 100ml.3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前较佳的方法为金胺酚改良抗酸染色法。对 于新鲜粪便或经 10福尔马林固定保存（41 个月内）的含卵囊粪便都可用此 法染色。染色过程是先用金胺酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤 如下：金胺酚染色法：染液配制：1gL 金胺酚染色液（第一液）：金胺 0.1g，石碳酸 5.0g，蒸馏水 100ml；3盐酸酒精（第二液）：盐酸 3ml，95酒精 100ml；5gL 高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾 0.5g，蒸馏水 100ml.染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1015 分钟后水洗；滴加第二

4、 液，1 分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发现乳白色荧光。高倍镜下卵 囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，似环 状，或深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光 颗粒，应注意鉴别。改良抗酸染色法：染液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红 4g， 95酒精 20ml，石炭酸 8ml，蒸馏水 100ml；10硫酸溶液（第二液）：纯硫酸 10ml， 蒸馏水 90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中；20gL 孔雀绿液（第三液）： 20gL 孔雀绿原液 1ml，蒸馏水 10ml.染色

5、步骤：滴加第一液于粪膜上，1.510 分钟后水洗；滴加第二液， 110 分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。经染色后，卵囊为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共 4 个。其他非特异颗粒 则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。不具备荧光镜的实验室，亦可用上述方法先后染色，然后在光镜低、高倍 下过筛检查，发现小红点再用油镜观察。效果好，可提高检出速度和准确性。2.厚涂片透明法（改良加藤法）取约 5mg（已用 100 目不锈钢筛除去粪渣） 粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便 铺开（2025mm）。置于 3036温箱中约半小时或 25约 1 小时。待粪膜 稍干

6、，即可镜检。玻璃纸准备：将玻璃纸剪成 2230mm 大小的小片，浸于甘油孔雀绿溶 液（含纯甘油 100ml、水 100ml 和 3孔雀绿 1ml 的水溶液）中，至少浸泡 24 小时，至玻璃纸呈现绿色。使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间。如粪膜厚，透明时间短， 虫卵难以发现；如透明时间过长，则虫卵变形，也不易辨认。3.浓聚法沉淀法：原虫包囊和蠕虫卵的比重大可沉集于水底，有助于提高检出率。 但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。1）重力沉淀法：取粪便 2030g、加水成混悬液，经金属筛（4060 孔） 或 2、3 层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置 25 分钟， 倒去

7、上液，重新加满清水，以后每隔 1520 分钟换水一次（34 次），直至 上液清晰为止。最后倒去上液，取沉渣作涂片镜检。如检查包囊，换水间隔时 间宜延长至约 6 小时换一次（图 212）。图 212 粪便沉淀及毛蚴孵化法2）离心沉淀法：将上述滤去粗渣的粪液离心（15002000rpm/min）12 分钟，倒去上液，注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀 34 次，直至上液澄 清为止，最后倒去上液，取沉渣镜检。3）汞碘醛离心（MIFC）沉淀法：粪便 1g，加适量（约 10ml）汞碘醛液， 充分调匀，用 2 层脱脂纱布过滤，再加入乙醚 4ml，摇 2 分钟，离心 （2000rpm/min）12 分钟，即

8、分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物 4 层。吸弃 上面 3 层，取沉渣镜检。汞碘醛配制：汞醛（MF）液：11000 硫柳汞酊 200ml，甲醛（40）25ml，甘油 50ml，蒸馏水 200ml.卢戈氏液：碘 5g，碘化钾 10g，蒸馏水 100ml.检查时取汞醛液 2.35ml 及 5卢戈氏液 0.15ml 混合备用。但混合液在 8 小 时后即变质，不应再用；碘液亦不这且于 1 周后再用。4）醛醚沉淀法：置粪便 12g 于小容器内，加水 1020ml 调匀，将粪便 混悬液经 2 层纱布（或 100 目金属筛网）过滤，离心（2000rpm/min）2 分钟； 倒去上层粪液，保留沉渣，加水 10ml

9、 混匀，离心 2 分钟；倒去上液，加 10 甲醛 7ml.5 分钟后加乙醚 3ml，塞紧管口并充分摇匀，取下管口塞，离心 2 分 钟，即可见管内自下而上分为 4 层。取管底沉渣涂片镜检。如检查原虫包囊， 可加卢戈氏液染色，加盖片镜检。浮聚法：利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体 表面。常用的方法有两种：1）饱和盐水浮聚法：此法用以检查钩虫卵效果最好。用竹签取黄豆粒大小 的粪便置于浮聚瓶（高 3.5cm，直径约 2cm 的圆形直筒瓶）中，加入少量饱和 盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口，但不溢出为止。此时在瓶 口覆盖一载玻片，静置 15 分钟后，将载玻片提起并迅速翻转

10、，镜检（图 213）。图 213 饱和盐水浮聚法饱和盐水配制：将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐 不再溶解为止。2）硫酸锌离心浮聚法：此法可用于检查原虫包囊，球虫卵囊和蠕虫卵。取 粪便约 1g，加 1015 倍的水，充分搅碎，按离心沉淀法过滤，反复离心 34 次，至水清为止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重 1.18 的硫酸锌液（33的 溶液），调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约 1cm 处，离心 1 分钟。用金属环取 表面的粪液置于载玻片上，加碘液一滴，镜检。3）蔗糖离心浮聚法：此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约 5g，加水 1520ml，以 260 目尼龙袋或 4 层纱

11、布过滤。取滤液离心 510 分钟， 吸弃上清液，加蔗糖溶液（蔗糖 500g，蒸馏水 320ml，石炭酸 6.5ml）再离心， 然后如同饱和盐水浮聚法，取其表液膜镜检（高倍或油镜）。卵囊透明无色， 囊壁光滑，内有一小暗点和发出淡黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中 浮力较大，常紧贴于盖片之下，但 1 小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即 镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖溶液。常见蠕虫卵、包囊的比重如表 211。表 211 蠕虫卵及包囊的比重虫卵或包囊比重 华支睾吸虫卵1.1701.190 姜片吸虫卵1.190 肝片形吸虫卵1.200 日本血吸虫卵1.200 带绦虫卵1.140 微小

12、膜壳绦虫卵1.050 钩虫卵1.0551.080 鞭虫卵1.150 蛲虫卵1.1051.115 受精蛔虫卵1.1101.130 未受精蛔虫卵1.2101.230 毛圆线虫卵1.1151.130 溶组织内阿米巴包囊1.0601.070 结肠内阿米巴包囊1.070 微小内蜒阿米巴包囊1.0651.070 蓝氏贾第鞭毛虫包囊1.0401.0604.毛蚴孵化法 依据血吸虫卵内的毛蚴在适宜温度的清水中，短时间内可 孵出的特性而设计的方法，适用于星期血吸虫病患者的粪便检查。取粪便约 30g，先经重力沉淀法浓集处理，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水（城市中 需用去氯水）至瓶口，在 2030的条件下经 46

13、小时后肉眼或放大镜观察 结果。如见水面下有白色点状物作直线来往游动，即是毛蚴。必要时也可用吸 管将毛蚴吸出镜检。如无毛蚴，每隔 46 小时（24 小时内）观察一次。气温 高时，毛蚴可在短时间内孵出，因此在夏季要用 1.2食盐水或冰水冲洗粪便， 最后一次才改用室温清水（图 212）。毛蚴促孵法：将沉淀法处理后的粪便沉渣置于三角瓶内，不加水，或将粪 渣置于吸水纸上，再放在 2030温箱中过液。检查时，加清水，2 小时后就 可见到孵出的毛蚴。此法毛蚴孵出时间较一致，数量也较多。5.肛门拭子检查法 适用于在肛周产卵（蛲虫），或常在肛门附近发现虫 卵（带绦虫）的虫卵检查法。棉签拭子法：先将棉签浸泡在生理

14、盐水中，取出时挤去过多的盐水，在 肛门周围擦拭，随后将棉签放入盛有饱和盐水的试管中，用力搅动，迅速提起棉签，在试管内壁挤干盐水后充去，再加饱和盐水至管口处，覆盖一载玻片， 务使其接触液面，5 分钟后取载玻片镜检。也可将擦拭肛周的棉签放在盛清水 的试管中，经充分浸泡，取出，在试管内壁挤去水分后弃去。试管静置 10 分钟， 或经离心后，倒去上液，取沉渣镜检。透明胶纸法：用长约 6cm，宽约 2cm 的透明胶纸粘擦肛门周围的皮肤， 取下胶纸，将有胶面平贴玻片上，镜检。6.试管滤纸培养法 也称钩蚴培养法。根据钩虫卵在适宜条件下可在短时 间内孵出幼虫的原理设计的方法。如冷开水约 1ml 于洁净试管内（1

15、10cm）， 将滤纸剪成与试管等宽但较试管稍长的 T 字型纸条，用铅笔书写受检者姓名或 编号于横条部分。取粪便约 0.20.4g，均匀地涂抹在紧竖条纸条的上部 23 处，再将纸条插入试管，下端浸泡在水中，以粪便不接触水面为度。在 2030条件下培养。培养期间每天沿管壁补充冷开水，以保持水面位置。3 天后肉眼或放大镜检查试管底部。钩蚴在水中常作蛇形游动，虫体透明。如未 发现钩蚴，应继续培养观察至第 5 天。气温太低时可将培养管放入温水（30 左右）中数分钟后，再行检查（图 214）。图 214 钩蚴培养法此法亦可用于分离人体肠道内各种阿米巴滋养体及人毛滴虫滋养体，且能 提高检出率。但是，每管粪便

16、量应为 1.0g；适宜温度为 2530；培养时间为 24 天。临床上为了及时报告致病原虫，可于培养 48 小时后镜检。检查肠道 各种原虫，仍应结合碘液涂片法以检出原虫包囊。7.虫卵计数法 虫卵计数用于估计人体内寄生虫的感染度，常用司徒尔 （Stoll）氏法，即司氏稀释虫卵计数法（图 215）。图 215 司氏虫卵计数法图 216 定量板用特制的三角烧瓶（或普通三角烧瓶），容量为 65ml 左右，在烧瓶的颈部 相当于 56 和 60ml 处有两个刻度。先把 0.1mol/l NaOH 溶液倒入瓶内至 56ml 处， 再慢慢地加入粪便，到液面上升到 60ml 处，然后放进玻璃珠 10 余颗，用橡胶 塞塞紧瓶口，充分摇动，使其成为十分均匀的混悬液。计数时充分摇匀，用有刻度的小吸管取 0.075 或 0.15ml 粪液置于载玻片上， 加盖片，在低倍镜下计算全片的虫卵数。乘以 200（吸 0.07