基因工程制药-复习

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1、一、一、名词解释名词解释1.杂交杂交 核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条（DNA 或 RNA）单链在适宜的温度及离子强度 等 条件下，可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。 2.探针：探针：一段序列已知的单链核酸片段，通过互补的方式检测单链核苷酸序列。 3.粘粒粘粒 粘粒载体（cos 质粒载体）：Cos 质粒是一类人工构建的含有 -DNA cos 序列和质粒复制 子 的特殊类型的载体。 4.同尾酶：同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 如 BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等。 5.同裂酶：同裂酶：来源不同的内切酶，识别和切割的是同样的核苷酸靶序列的酶。 不同同裂

2、酶对位点的甲基化敏感性有差别，用来研究甲基化作用。 6.cDNA 文库：文库：某生物 mRNA 反转录产生 cDNA 片段分别与合适的克隆载体相连，通过 转化贮存在一种受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因组全部基因 cDNA 的受体菌群体，称为该生物 cDNA 文库。 7.基因工程药物：基因工程药物：指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白（多肽） 药物、反义核酸药物、DNA 药物和基因工程抗体等。 8.盐析盐析 盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 9.星活性星活性 星号（*）活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH 值等，会使一些

3、核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。 EcoRI*代表 EcoRI 的星号活力。 星活性的特点：限制酶识别序列特异性降低 例如：EcoRI（高 pH 值或低盐离子强度） 5G AATTC3变成 5N AATTN3，另有一种情况是对 AATT 中的 A、T 分辨不严格。二、二、简答题简答题1.如何克隆微生物的纤溶酶基因？如何克隆微生物的纤溶酶基因？ PCR 法分离目的基因：法分离目的基因：根据核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对 mRNA 进行反 转录得到 cDNA，以 cDNA 为模板，然后将目的基因通过 PCR 方法扩增，或者直接从基因 组 DNA 扩增的方法

4、。 根据已知探针克隆基因：根据已知探针克隆基因：首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处 理的基因组 DNA 杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体（质粒、 噬菌体或病毒）中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来，还能同时 观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后，要注意高强度漂洗，以避免干扰信号， 即保证克隆的特异性，同时节省时间。 用特异抗体克隆基因：用特异抗体克隆基因：在获取理想的抗体后，可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或 cDNA 文库，从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。 若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，则若控制该性

5、状的目的蛋白质不容易分离纯化，则 PCR 方法比较适宜，若蛋白质分离纯化方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。2.获得目的基因的途径有哪些？获得目的基因的途径有哪些？一、化学合成法一、化学合成法（一）化学合成法的单元操作（一）化学合成法的单元操作 从反应机理上分为：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法 操作过程：液相合成、固相合成 化学合成一般由专门的公司完成，也可以通过基因合成仪自己完成。 （二）基因组装战略（二）基因组装战略 1、小片段粘接法：、小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成

6、1215 碱基长的单链 DNA 小片段。 预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双 链。 2、补丁延长法：、补丁延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成 1215 碱基长的单链 DNA 小片段以及 2030 碱基长的单链 DNA 中片段。 预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。 3、大片段酶促法：、大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成 4050 碱基长的单链 DNA 片段。 预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物。 （三）（三）DNA 化学合成的用途化学合成的用途 合成天然基因：胰岛素基因、干扰素等合成天然基因

7、：胰岛素基因、干扰素等有些基因比较短，化学合成费用较低。 修饰改造基因，设计新型基因修饰改造基因，设计新型基因 “人造儿”2010，5.20，美国 64 岁科学家 10 年耗资 4000 万美元 用电脑进行基因设计改造后，用 化学方法合成基因后导入到支原体细菌，DNA 象正常细菌的基因一样进行复制人造生 命诞生。 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 定点突变合成：合成带有定点突变的基因片段定点突变合成：合成带有定点突变的基因片段二、二、PCR 技术（多聚酶链式反应）获得目的基因技术（多聚酶链式反应）获得目的基因缺点：DNA 聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加 DNA 聚合酶。 1、已

8、知序列基因的分离、已知序列基因的分离 （1）已知序列是）已知序列是 DNA 片段片段 根据研究的目的，通过已知 DNA 序列设计相应引物，直接利用 PCR 方法进行分离。 根据已知序列克隆基因根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。 目前，世界上主要的基因库有： EMBL，为设在欧洲分子生物学实验室的基因库 Genbank，为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库 Swissport 和 TREMBL，Swissport 是一蛋白质序列库，其所含序列的准确度比较高，而 TREMBL 只含有从 EMBL 库中翻译过来的序列 （2）若已知基因的）若已知基因的 m

9、RNA 序列，如何克隆该基因？序列，如何克隆该基因？ 首先要分离（或纯化）mRNA A：根据 mRNA 序列直接设计引物 B：根据 mRNA 序列设计一条引物和 OligoT/A 引物进行 PCR 扩增 C：逆转录，以获得的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增 2、未知序列基因的分离、未知序列基因的分离 （1）序列在其他物种上已有报道）序列在其他物种上已有报道 具体做法： 首先找出上述几个物种的 PDS 基因序列，进行比对 寻找出其保守序列，根据保守序列设计引物（或简并引物） PCR 扩增（DNA 或 RNA 为模板） 如何根据蛋白序列克隆基因？ （2） 已知部分序列，但不完全已知部分序列，

10、但不完全 可采取可采取 RACE 技术技术 cDNA 末端快速扩增技术是基于 PCR 技术由已知的部分 cDNA 序列来获得完整 cDNA 序列 的一种方法。 3RACE 原理原理 利用 mRNA 的 3末端的 poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART 寡核苷酸 序列通用接头引物的 Oligo（dT）30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。 然后用一个基因特异引物 GSP1 作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM 作为下游引物，以 cDNA 第一链为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 3末端的 DNA 片段 扩增出来。 5RACE 原理原理 先

11、利用 mRNA 的 3末端的 poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以 Oligo（dT）30MN 作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下，反转录合成标准第一链 cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的 5末端时自动加上 35 个 （dC）残基，退火后（dC）残基与含有 SMART 寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物 配对后，转换为以 SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。 然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM 作为上游引物，用一个基因特异引物 2 （GSP 2）作为下游引物，以 SMART 第一链 cDNA 为模板，进行 PCR 循

12、环，把目的基因 5末端的 cDNA 片段扩增出来。 最终，从 2 个有相互重叠序列的 3/ 5-RACE 产物中获得全长 cDNA，或者通过分析 RACE 产物的 3和 5端序列，合成相应引物扩增出全长 cDNA。 （2）序列未报道）序列未报道 反向反向 PCR：根据已知 DNA 区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化 DNA 分子 为模板来扩增未知 DNA 区序列的 PCR 技术。 TAIL-PCR，即交错式热不对称交错式热不对称 PCR，是一种染色体步移技术染色体步移技术。 根据已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物，与经过独 特设计的退火温度较低的兼并引物（

13、可以设计多条） ，进行热不对称 PCR。 通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异 进行热不对称 PCR 反应，一般通过三次巢式 PCR 反应即可获取已知序列的侧翼序 列。 如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列 信息，继续进行侧翼序列获取。 随着基因组测序技术的发展，以 PCR 途径获得目的基因的重要性更加突出！三、基因文库法获得目标基因三、基因文库法获得目标基因基因库：基因库：特定生物体全基因组的集合（天然存在） 。每个种群都具有其独特的基因库。 基因文库：基因文库：通过克隆的方法将某一基因组 DNA 或 mRNA 保存于适

14、当宿主菌中形成的转化 子群。所有重组 DNA 组合代表该基因组的全序列。 根据构建方法构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库基因组文库和 cDNA 文库文库 （一）基因文库的容量和完备性（一）基因文库的容量和完备性 在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数 N 之间的关系可 用下式表示：N = ln（1-P）/ln（1-f）P = 任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率F = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/生物基因组的大小生物基因组的大小 影响因素：影响因素：基因组大小、目的基因在基因组中的拷贝数、克隆载体的容量及目的

15、基因的大 小 基因文库的完备性：基因文库的完备性：在构建的基因文库中任一基因存在的概率。完备性越高，文库容量越 大。 例：人的单倍体 DNA 总长为 2.9109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为 15 kb，则构 建一个完备性为 0.9 的基因文库至少需要 45 万个克隆；而当完备性提高到 0.9999 时，基因 文库至少需要 180 万个克隆。 （二）理想基因文库条件（二）理想基因文库条件 1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为 99% 2、重组克隆的总数不宜过大 3、载体的装载量最好大于基因的长度 4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下 6

16、、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 （三）基因组文库及其构建程序（三）基因组文库及其构建程序 基因组文库：基因组文库：包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列 DNA 片段，通过克隆载体贮存 在一种受体菌的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。 文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖该生物的整个基因组。 基因组文库的构建程序基因组文库的构建程序 1、基因组、基因组 DNA 的制备和切割的制备和切割（保证 DNA 片段之间存在部分重叠；DNA 片段大小均一） 超声波处理；限制性内切酶部分酶切 2、载体和受体的选择、载体和受体的选择载体：载体：-DNA 或 cosmid 质粒，大型基因组使用 YAC 或 BAC受体：受体：大肠杆菌或酵母菌 3、DNA 片段和载体的相连片段和载体的相连 直接连接、人工接头或同聚物加尾 4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库、重组体转化宿主细胞，