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1、第 1 页 共 25 页前言呕吐是一个复杂的反射过程，主要有前庭器官，胃，十二指肠等内脏及延髓化学催吐感受区（CTZ ）等传入神经冲动作用于延髓呕吐中枢而引起的。诱发呕吐的因素除胃肠道等内脏疾病外，还有前庭功能紊乱，药物（如化疗药等），放疗等因素。已知CTZ含有丰富的D2,H1,M1和 5-HT3受体。托烷司琼为外周神经元和中枢神经系统内5-HT3受体的高选择性抑制剂。抗癌药物或放疗可激发小肠粘膜的嗜铬细胞释放5-HT3，诱导呕吐反射，造成恶心和呕吐而出现脱水等不良后果。本品选择性抑制外周或中枢神经系统的突触前膜的5-HT3受体的兴奋， 并可能对中枢神经系统的迷走神经传入后区有直接影响，这种双
2、重作用阻断了呕吐反射过程中神经介质的化学传递，从而对化疗及放疗引起的呕吐有治疗作用。托烷司琼口腔崩解片是以盐酸托烷司琼为主药，加填充剂，高效崩解剂，矫味剂和芳香剂制成的一种在口腔内迅速崩解，无沙砾感，口感良好的新制剂。近年来，国内外学者对托烷司琼的人体生物等效性进行了诸多研究，这些研究成果为临床合理应用提供了坚实的理论和试验基础， 但其具体的研究方法仅有为数不多的报导以及不同试验单位由于仪器等客观条件的不同，因此各研究方法也不相同。实验部分1. 伦理学相关资料本生物等效性试验严格遵守赫尔辛基宣言（the Declaration of Helsinki ）的人体医学研究的伦理准则，临床试验方案已
3、经海南医学院附属医院伦理委员会（IEC 或 IRB）审核批准。2. 受试者的筛选根据 GCP 的要求，组织志愿者参加体检并从中选择20 名健康男性受试者 ,年龄为 ( 21 . 1 1 . 73)岁 , 身高为 (173 6 . 41) cm,体质量为 (64 . 3 7 . 11) kg, 体重偏差不超过中国人标准体重的 10% , 体质量指数 (BM I ) 为( 21 . 42 1 . 16) kgm- 2。试验前 14 天内筛选。全面体检及实验室检查包括血、尿常规 , 肝、肾功能等和 ECG 。 受试前 1 周内未吸烟、饮酒 ,受试前 1 月内未使用其他任何药物。受试者在试验期间禁烟、
4、酒及任何含醇食品。均签署知情同意书。试验方案经本院伦理委员会审批同意。3. 分组、给药与血样采集20 名受试者随机分为甲、乙两组 ,每组 10 人。第一周期甲组口服受试制剂2片 (相当于盐酸托烷司琼10 mg) ,乙组口服参比制剂2 片 (相当于盐酸托烷司琼 10 mg) ;第二周期甲组口服参比制剂2 片 ,乙组口服受试制剂2 片。于口服前( 0 h) 和服药后 0.33 、0.5 、0.75 、1.0 、1.5 、2.0 、2.5 、3.0 、4.0 、8.0 、12.0 、24.0 、 48.0 由前臂静脉取血 5 mL并立即移入经肝素处 理 的 离 心 试 管 中 , 离 心 10 mi
5、n(5 000 r min - 1) ,分离血浆 , 于 -80 冰箱中冷冻待测。4. 生物标本的测定方法采用 HPLC/MS 法测定。4.1 仪器Agilent 1200型系列高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、化学工作站） - Agilent 6110 四级杆质谱系统（ LC-MS ）(美国Agilent 公司)；TL-16R台式高速冷冻离心机 ( 上海市离心机械研究所 ), XW-80A旋涡混合器 (上海医科大学仪器厂 ), 岛津AX200 型电子天平 (日本) ，SZ - 型自动三重纯水蒸馏器（上海嘉鹏科技有限公司），TDZ4 WS 低速台式离心机（长沙湘仪
6、离心机仪器有限公司）等。4.2 试剂与药品盐酸托烷司琼对照品由海南绿岛制药有限公司提供(批号： 080302-1 含量:99.6% )，山东益康药业有限公司生产的盐酸托烷司琼胶囊（规格：5mg；批号： 0903291） ，富马酸比索洛尔对照品由海南绿岛制药有限公司提供(批号：080701 含量:99.8% )。甲醇 (美国 Fisher 公司生产 ,色谱纯 ),甲酸(广东光华化学厂有限公司 , AR ) ，二氯甲烷，乙醚（广州化学试剂厂, AR），纯化水（海南医学院附属医院国家药物临床试验机构自制）。4.3 色谱条件流动相：甲醇： 0.4%甲酸水溶液（ 52：48） ，色谱柱：大连依利特Sin
7、oChrom ODS BP 5m，4.6 150mm，柱温为 35，流速为 0.4ml/min。4.4 质谱条件离子源为 API - ES 源，正离子方式检测，扫描方式为选择反应监测（SIM）,用于定量的离子反应为托烷司琼母离子m/z 285，比索洛尔母离子m/z326，碰撞诱导解离 120， 干燥气体流速 10L/min， 干燥气为氮气，温度 300， 压力为 40psig，毛细管电压 3000V。4.5 标准液的配制精密称取对照品盐酸托烷司琼10.04mg , 以少许甲醇： 水（1:1）溶液溶解 , 再用甲醇水溶液定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml 的贮备液；精密称取对照品富
8、马酸比索洛尔10.02mg , 以少许乙腈溶解 , 再用乙腈定容至 100ml， 即配制成浓度为0.1mg/ml 的贮备液。将这两种贮备液置4冰箱中保存，使用时用相应的溶剂稀释至所需浓度。4.6 样品处理精确吸取肝素化血浆0.5ml 置于 10ml 玻璃离心管中，加入含内标的乙腈溶液 100l（250ng/ml） ，加入 0.2mol/L NaOH 100l，涡旋 30s，加入提取液（二氯甲烷：乙醚 =2:3）3ml, 涡旋 4min，于 3500r/min 离心 10min，精密取上清液2ml，在 45水浴下通氮气吹干，残留物加流动相200l 溶解， 吸取 20l 进样 LC-MS 测定。4
9、.7 色谱图图 1、2、3、4、5 分别为空白血浆（ 6 个不同来源）色谱图、空白血浆加对照品色谱图、 空白血浆加内标物色谱图、 空白血浆加对照品和内标物及受试者服药后 3h 血浆样品色谱图。从图中可以看出，托烷司琼的出峰时间约为45min，比索洛尔的出峰时间约为67min。托烷司琼、比索洛尔与血浆中内源性物质分离良好。第 4 页 共 25 页m /z1 0012515017520022525027 53000204060801 00*M SD 1SP C,tim e=4 .702o fD:DA TA盐 酸 托 烷 司 琼方 法 学 第 1天托 烷 司 琼 .D ES -A PI,P os,S
10、can,Fra g:120M ax:.7.78.28.36.50.96.808.648.8273.9123.8130.7图1 盐酸托烷司琼质谱图m /z1 0015 02 0 02 5 03 0002 04 06 08 01 0 0*M S D 1S P C ,tim e= 4.30 9o fD :D A T A盐 酸 托 烷 司 琼 方 法 学 第 1天 比 索 洛 尔 .D E S -A P I,P o s ,S ca n ,F ra g :12 0M ax:.5.930.7325.6图2 富马酸比索洛尔质谱图第 6 页 共 25 页图 3. 空白血浆总离子流图（分别作6 个不同样本）图4
11、. 托烷司琼对照品总离子流图图5. 空白血浆加对照品加内标物总离子流图图6. 空白血浆加对照品加内标物总离子流图图 7. 受试者服药后 3.0h血浆样品外加内标物总离子流图4.8 线性范围及最小检出浓度用空白血浆配制相当于托烷司琼浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0ng/mL 的样品，按“血浆样品处理 ” 项下操作， 记录托烷司琼和内标物的峰面积，以托烷司琼样品浓度(ng/ml)对托烷司琼峰面积A1 与内标物峰面积A2 的比值作直线回归，线性方程：Y=43.715X-0.2977，线性范围为 1.0-64.0ng/ml, 相关系数 R20.9988（图 6 ）
12、 。标准曲线重复测定如下：Y=42.8646X-0.3343 R20.9990 Y=42.5126X-0.3620 R20.9988 各检测批次随行曲线如下：第一批：Y=42.2451X-0.3484 R20.9996 第二批：Y=42.3535X-0.4161 R20.9996 第三批：Y=41.9538X-0.2862 R20.9987 第四批：Y=42.3819X-0.3384 R20.9991 第五批：Y=42.6927X-0.2718 R20.9991 以标准曲线线性范围的最低点浓度作为定量下限，则最低定量限为1ng/mL（重复 5次， RSD5.82%、S/N 10）图 8 最低检
13、测限 (LLOQ) 图9：方法学标准曲线图 10 样品随行标准曲线 4.9 介质效应考察配制三套标准系列 (SET 1，SET 2，SET 3)；SET 1 为纯标准样加溶剂或流动相，SET2为萃取空白血浆后加标准样，SET3为标准加入空白血浆后萃取。分别进样，记录峰面积。萃取回收率SET 3/ SET 2*100，基质效应 SET 2/ SET 1*100，结果见表（ 1）。4.10 提取回收率用空白血浆配制相当于托烷司琼浓度为2.0、8.0、32.0ng/mL 的样品各 5 份，按样品处理方法处理后测定,记录对照品峰面积 (A1)和内标物峰面积 (A2),并计算所得峰面积比值 (A1/A2
14、) ； 另直接以进样浓度平行配制的对照品溶液进样所得的峰面积之比值 (A1/A2), 以两组峰面积比的比值 ,计算萃取后回收率在73.982.8%间结果见表（ 1）。表 1 基质效应和萃取回收率（n=7）浓度面积回收率基质效应 （ng/ml ）Set1 Set2 Set3 (%) (%) 1.0 10686.9 10190.5 8140.6 79.88 95.36 2.0 16188.6 17663.5 14621.9 82.78 109.11 4.0 34498.9 35113.2 27125.1 77.25 101.78 8.0 67678.8 68545.6 52420.3 76.48
15、101.28 16.0 129124.9 137836.7 101909.6 73.94 106.75 32.0 279944.2 279113.0 215179.6 77.09 99.70 64.0 529892.6 548564.8 429885.6 78.37 103.52 内标368136.2 361785.0 280682.5 77.58 98.27 4.11 精密度与准确度：取空白血浆及对照品溶液，按“线性范围和最小可定量浓度”项下方法制备托烷司琼低、中、高三个浓度（2.0、8.0、32.0ng/ml）的质量控制（ QC）样品，每一浓度平行操作5 份，代入线性方程计算浓度，以测得值
16、与加入值的比值计算回收率，并计算日内精密度，结果见表（2）。连续 3 天配制并测定上述浓度样品，考察方法日间精密度。结果见表（3）。方法的回收率均在93.98115.11%之内，日内、日间 RSD 均小于 4.02%。符合生物等效性研究的方法学要求。表 2 方法回收率及日内精密度（n=5）浓度ng.ml-1测定值平均回收率（%）RSD（%） 1 2 3 4 5 2.0 2.3022 2.2378 2.2763 2.2465 2.1667 112.29 2.27 8.0 8.2212 8.2172 8.1428 8.1334 8.0875 102.01 0.71 32.0 35.9462 32.3618 32.0514 35.9325 33.9880 106.42 5.49 表 3 日间精密度（ n=15）测定日期托烷司琼血浆浓度（ ng/ml） 2.0 8.0 32.0 第一天2.3022 8.2212 35.9462 2.2378 8.2172 32.361
