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1、沙门氏菌 typhimurium 的 cysJIH 区域的描述而且大肠杆菌 B为 SIROHEMEFe4 S4 有效中心的 cysl 及 cysH 及 A 模型的去氧核醣核酸序列，用菠菜基于胺基酸同系现象的 REDUCTASE 血红素蛋白REDUCTASE（为出版收到， 1989 年三月 15 日)亚硫酸盐亚硝酸盐Jacek Ostrowski, JerYuarn 的 Wu5 ll，大卫 C. RuegerllII，巴尼 E. 米勒*, 路易斯 M. Siegel ll,而且尼古拉斯 M. Kredich 5从霍华德修医疗的学会实验室和部门 生物化学和 医学，公爵大学医疗中心、达拉姆、北卡罗莱
2、那州 27710 和 TBasic 科学区分，退伍军人政府医疗中心，达拉姆，北卡罗莱那州 27705沙门氏菌 typhimurium 的血红素蛋白成分亚硫酸盐 reductase（还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸）(EC 1.8.1.2) 是cysJ 266 的被净化的 toh omogeneity 一，突变异种紧张缺乏的亚硫酸盐 reductase 黄素蛋白。sirohemeandFe4 S4-containinge 的 nzyme 被隔离了当做一单节显性的63 kDa 的多月太而且有了一个混合不结扎的酶和一个合成物以亚硫酸盐。下列各项还原反应与 5“deazaflavinEDTAa 的 nd 再
3、化氧化作用，合成物被转换到这不合成物，高度地快速旋转含铁siroheme 的州 seenp reviously藉由大肠杆菌亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白准备。S。typhimurium 血红素蛋白展现接触反应的和物理性质相同这被大肠杆菌的尿素分解准备的血红素蛋白亚硫酸盐 reductase 全濥而且完全能干在再构成还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐的 reductase 活性方面当以被净化亚硫酸盐 reductase 的过度联合黄素蛋白。cysl 和 cysfHro m S 的去氧核醣核酸序列。typhimurium而且大肠杆菌 B 被决定了和，一起与先前报告数据，确认组织这一个区域
4、当做促进剂cysJcysIcysH 与所有三个基因在相同的方向定向从这促进剂。分子的压重为 CYSIencoded 推论亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白和为这cysH改为暗码 3“- phosphoadenosine 5“-phosphosulfatesulfotransferase 大约 64,000 和28,000, 分别地。比较这推论亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白的胺基酸序列藉由 thato f 菠菜亚硝酸盐 reductase （BacEk，.， Burkhart，W。， Moyer，M。， Privalle，L。，而且 Rothstein，S。（1988) 摩尔。麝
5、猫科将军。212,20-26), 哪一个也包含siroheme 和 Fe4 S4 群，表示二群体包含半胱胺酸的序列与这s t ructures C顺式 (X）-acnyds Cys(X）REP，重复的 extragenicpalindromic；HPLC，高成形液体色谱法。Ostrowski，J。，理发师、 M. J. 、 Rueger 、 D. C. 、米勒、 B. E. ， Siegel，L. M. 和 Kredich，N. M.（1989) J. Biol。Chem。264, 在杂志报纸中。15726cysJIH 描述和亚硫酸盐 Reductase 血红素蛋白 15727在早先的研究中在
6、这之上物理化学、接触反应的爵士的性质HP， thefr ee 血红素蛋白已经被获得4 或 5 只有藉着大肠杆菌 B 爵士全濥的分解M 尿素. （5)决定如此的准备是否可能有被 urfea 治疗改变，我们已经隔离爵士HP直接地从 S。typhimurium cysJ 266, 突变异种紧张哪一不能够制造全濥的爵士FP 成分。Siegel 等人 （18) 先前发现那爵士全从大肠杆菌 B 和 S。typhimurium 几乎同一被分光镜、接触反应、和免疫化学的标准，和结果在这里报告标示爵士HP 净化从 S。typhimurium cysJ 266 对那事实上同一从大肠杆菌 B 爵士全濥的尿素治疗获得
7、。在加成，我们在这里报告 cysZH 的去氧核醣核酸序列S 的区域。typhimurium 和大肠杆菌 B 和礼物描述cysJIH 的全部组织，开着的阅读框架对 cysZ 和 cysH 符合，和比较被推论的爵士HP 的胺基酸序列改为暗码被cysZ 与为菠菜 ferredoxin 根据背等人 （19) 报告亚硝酸盐 reductase（EC 1.7.7.1).这一个比较，一起藉由 crystallographic 和分光镜的数据在这文学为大肠杆菌爵士HP 和菠菜亚硝酸盐 reductase，已经领导我们为活性部位结构计画一个模型这些酶。实验的程序材料爵士FP 从 S 被净化。typhimuriu
8、m cysG 439 被Ostrowfki et 的程序一 1.黄素蛋白的浓度坚决的 spectrophotometrically 正在使用 c 456=10.9(毫莫耳黄素）“ cm1.2 爵士HP 被大肠杆菌的尿素分解准备了如 Siegel 和戴维斯所描述的 B 爵士全濥. （5)链霉素硫酸酯来自于希腊文的第十八个字母， Pharmacia 的塞法戴克斯 G-150(过细的）LKB 生物科技公司、和 DE-52 microgranular 二乙胺基乙基纤维素来自于华特曼纸。5 水溶液-deazaflavin，一有雅量的大卫 Seibrert 博士的礼物，是被准备而且定量的 spectrop
9、hotometrically如 Massey 和 Hemmerich 所描述（20).细菌的紧张、媒体和质体细菌的紧张用在第一桌子被描述。（8,21-25)最小的媒体是萣生熟的 E（26) 除了 maxicell 实验以外以 0个 5% 葡萄糖补充哪里 M9 介质 . （27)藉由 0.5% 葡萄糖和 1% casamino 酸被用了。（24)富有的媒体为质体变形有了磅而且为 M13 抗菌素生产的 YT. （27)固体媒体包含了 1.5% 琼脂，青霉素在 25 毫克升被增加了当适当的为选择AmpR 劳累。cysJZH 藉由为 Cys 选择从染色体去氧核醣核酸被复制TABLEI细菌的紧张大肠杆菌
10、”BJA199EC1124CSR603 bcysG 439cysH 75cysZ 68c.ysJ 266S。typhimurium野性的类型 ATCC 11303AtrpE。5 罗马尼亚的货币单位6 thi hsdR hsdM J. 碳AtrpE。5 罗马尼亚的货币单位6 thi hsdR hsdM从 JA199 被第一 cys A. WiaterrecAl t 1 urA 6 phr1(23,241cysG 43.9cysH 75cysZ 68cysJ 266cysJZH 383 AcysJZFf383（22)LB5000 d metA 22!量 551 trpD 2个罗马尼亚的货币单位（2
11、5)hsdLT hsdSA hsdSB一个大肠杆菌衍生物是除了野性的类型大肠杆菌 B 以外的 K-12 衍生物。除了那些 rele 之外， CSR603 有多个基因标记S。typhimurium 紧张除了 hisG 70 以外是 LT2 衍生物,LB5000 是所有的三 S 的 mf 。typhimurium 修正制度。为 maxicells 的生产的对它的使用的 vant。LT7 是紧张。大肠杆菌 cysZ EC1124 的转化株.pGBK 5(图 1) 包含一 13.0-kb Sal1 S 的碎片。typhimurium LT7 紧张 hisG 70 插入进入 pBR 322 之内.(11
12、)pJYW 2(图 1) 包含一个 9.5 kb 的大肠杆菌 B 碎片获得从一本被插入的部分的 Sau3 A 文摘到这BamHI pBR 322 的位置.质体 pGBK 11 、 pJOK 20 ， pJOK 21,pJOK 22, 和 pJOK 23 包含 portionso f pGBK 5个插入物而且是在下面描述。进入 S 之内的下列介绍。typhimurium LB5000被变形，质体被转移到 othSer 。typhimurium抗菌素 p 的紧张斡旋 22HT 的转换. （28)测定还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸依赖的还原反应反应是在包含 0.05个 M 磷酸钾的 1.0 毫升体积中测
13、量，酸碱值 7.7, 0.1 毫莫耳 Na 、乙二胺四醋酸、 0.2 毫莫耳还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸， 0.1 p FMN，一充用酶的数量、和 0.5 毫莫耳亚硫酸盐或 10 毫莫耳当做一个电子受体的羟胺。cysJ 266 的爵士HP 是在 4 点在化验之前抱 5 分钟 “C 用 30个毫微莫耳（在黄素中）爵士FP 为了要再构成还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸爵士的全濥。这反应被酶，和减少的加成开始了在一 340在 25 被测量 “C 在卡里模型 14 分光光度计中反对一个包含所有反应成分的叁考溶液除这电子受体。计算为 6.22 还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸使用了 EM毫莫耳 “ cm“.MVH亚硫
14、酸盐的 reductase 活性厌氧地被化验如 Krueger 和 Siegel 所描述. （29)反应率被决定了在 600个 nm 的 spectrophotometrically“13 毫莫耳 “ 假定 ccm”为 MVH 化氧化作用. （30)一单位活性被定义为那酶的数量催化任一 1 pmol 的化氧化作用在 standarda 下面的还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸或 MVH最小的 2 pmol ssay 情况。爵士HPS 的洗净。typhimurium cysJ 266 缺乏能力合成爵士全濥的爵士FP 成分而且是一爵士FP 完全自由的爵士HP 的方便来源。细菌被连续的文化与精力充沛充气作用
15、成长了在一个 30-升发酵连接到在萣生熟的 E 中的一个 CEPA 离心机（26) 以 0.5% 葡萄糖和 0.15个毫莫耳 Ldjenkolic 酸补充当做一个限制的硫来源。在 5-10 X 10“ 毫升 “ 的密度的电池是在 8-9 的比率升h 收割了，当新鲜的介质被增加了的时候在相同的比率。在新鲜介质的 105个升的加成之后这使被抽干发酵，和电池浆糊在 -15 被储存了 “C直到进一步的使用。大约 1 克湿气重量每一升被获得介质。标示。爵士HP 被它的能力化验了催化 NADPHThe整个的洗净在 0-5 点被运行了 “C 除非另外羟胺的依赖还原反应当着爵士FP 面前从 S 净化。typh
16、imurium。这一个化验是三次当做敏感的当做还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐的 reductase 化验而且特别有用对天然萃取物的化验。di Jeso（31) 的反应式习惯于在 0 点计算百分比硫酸铵溶液的饱和 “C。对于准备在表 11 概述, 130 克冷冻电池在前一夜 4 点被融解 “C，中止的在 2 册标准方面缓冲液 （0.05个 M 磷酸钾， 0.1 毫莫耳 Na2 乙二胺四醋酸，酸碱值 7.7), 和150 毫升部分在温度被音波的振动打乱了维护在 5 和 15之间 “C 藉着被包含在的一个 Rosett 电池的使用一个冰的浴。电池和瓦砾堆的下列移动藉着离心分离60 分钟在 48,000 X g，浮在表面的部份 （天然的萃取物）是被 0.5 册一个链霉素硫酸酯的寒冷 10% 溶液混合的那被在标准的缓冲液中溶解而且与 5 N 一起被使中立KOH。这混合为 30 分钟被激起了而且离心分离机在 23,000为 90 分钟的 X g。链
