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1、小鼠骨髓细胞微核试验一、目的主要通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE ）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。二、原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/201/5 ，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两
2、种遗传学终点。微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中， 因此通常计数 PCE细胞中微核。三、器材与试剂（一） 、器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布，带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃染色缸、2ml 注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜细胞计数器。（二）试剂甲醇（分析纯） 、甘油（分析纯） 、小牛血清、生理盐水。1、吉姆萨(Giemsa) 贮备液 取 Giemsa 染料 1g，甘油 66ml，甲醇 60ml。先将染料置于研钵 内
3、，加入小量甘油混合研细，置60 C 水浴 2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2 周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该贮备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用Ph6.4的磷酸盐缓冲液配置为10%的应用液。2、磷酸盐缓冲液（1）甲液 1/15mol/L 磷酸氢二钠（ Na2HPO4）称取无水Na2HPO4 9.47g 溶于 1000ml 蒸馏水；含 2、7 和 12 份结晶水时，则分别称取11.89g、17.87 g 和 23.88g. （2）乙液 1/15mol/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）称取 KH2PO4 9.08g 溶于 1000ml 蒸馏水。为配制吉姆萨染液和吖啶橙染液，需配制3
4、 种磷酸盐缓冲液：1pH6.24 磷酸盐缓冲液，取甲液 20ml 和乙液 80ml 混合即可； 2pH6.47 磷酸缓冲液， 取甲液30ml 和乙液70ml 混合即可；3pH6.8 磷酸缓冲液，取甲液49.5ml 和乙液50.5ml 混合即可。各种 pH 的磷酸缓冲液配成后，可用pH 计加以校准，调节至所需的pH。3、吖啶橙染液（1）吖啶橙染液以0.1%吖啶橙水溶液作为贮备液。称取吖啶橙0.1g 溶于 100ml 蒸馏水中。置褐色瓶内，在4 C下可保存数周。（2）吖啶橙工作液以0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲液作为工作液，临用时配制。 取 2 份 0.1%吖啶橙贮备液，30 份 1/15m
5、ol/LpH6.8 磷酸缓冲液混匀即得。 四、操作步骤1 动物一般选用712 周的、体重2030g 的小鼠，也可选用体重150200g 的大鼠。每个剂量组至少用两种性别的动物各5只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加，每个采样时间至少有8 只动物。2 剂量及分组根据受试物的理化性质（尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ，确定溶剂。一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。一般在受试物的1/21/30 LD50范围内选择34 个剂量组。也可采用急性毒性试验中出现中毒而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入12个剂量组。 同时设对照组，即空白对照、溶剂
6、对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理盐水溶液一次腹腔注射3050mg/kg ，或以环磷酰胺水溶液80120mg/kg ，经口染毒两次，间隔 24h。3染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮下或肌肉注射等染毒途径。4染毒方法一般采用2 次染毒方法，两次间隔24h。5制片（1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股骨，剔去肌肉， 用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。 用配有 6 号针头 1ml 注射器吸取小牛血清约0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。（2）涂片将玻片上的冲洗物调匀后，推片若干张。 迅速干
7、燥， 可在酒精灯上短时烘烤。（3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定510min ，取出晾干。当日不染色的涂片亦应固定后保存。（4）染色固定好的涂片用1:10 的吉姆萨 -磷酸缓冲液（ pH6.4）染色 1530min。用蒸馏水冲洗，干燥，待检。为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲液内，染色23min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗3 次，每次12min。晾干后在荧光显微镜下观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应避光，以防荧光减弱或消失。（5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明6min，
8、取出后趁湿滴上适量中性树脂胶，盖上盖玻片， 平置。待干后却可收入盒内备检。若在短时内进行观察，涂片不需制成涂片。（6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好，作为判断制片优劣的标准。嗜多染红细胞 （PCE ）呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。每只动物需计数1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数，列入表实6-1。在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并以千分率表示。 微核率列入表实6-2。 另外，在计数 PCE时， 计数见到的NCE数， 求出 PCE/NCE
9、的比值。嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数100%表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计性别空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组雄鼠 N：1 2 3 4 5 雌鼠 N：1 2 3 4 5 注：表内数据是观察每个鼠的1000 个嗜多染红细胞而发现的微核的细胞数。表示 6-2 微核率统计剂量组动物数检查细胞总数含微核细胞数微核率（ %）空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组注：检查细胞总数=检查鼠数 1000 五、结果分析与评价本实验中只计数PCE中的微核， 微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、 雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、 雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算。正常的 PCE/NCE比值约为1（正常范围为0.61.2） 。如比值小于0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如比值小于0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，实验结果不可靠。阴性对照组合阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据组相一致。微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法 （如泊松分布、 三项分布、X2检验等） 均有人用于试验结果的分析。但在样本含量较小的情况下，资料的分布属性难以确定，多种统计学分析方法均可得到相同的分析结果。
