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1、食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1 范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica )的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其 随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 4789.4 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验3 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设
2、备和材料如下：3.1 冰箱： 2 5。3.2 恒温培养箱： 26 l、 36 l。3.3 显微镜： l0 l00 。3.4 均质器或灭菌乳钵。3.5 天平：感量0.1g。3.6 灭菌试管： 16 mm 160 mm、15 mm 100 mm。3.7 灭菌吸管： 1 mL( 具 0.01 mL 刻度 )、10 mL( 具 0.1 mL 刻度 )。3.8 灭菌锥形瓶： 200 mL 、500 mL 。3.9 灭菌培养皿：直径90 mm。3.10 全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK 。4 培养基和试剂4.1 改良磷酸盐缓冲液：见第A.1 章。4.2 CIN-1 培养基：见第A.2 章。4.3 改良
3、Y 培养基：见第A.3 章。4.4 改良克氏双糖培养基：见第A.4 章。4.5 糖发酵管：见第A.5 章。4.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A.6 章。4.7 半固体琼脂：见第A.7 章。4.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红 (MR) 和 VP 试验用 ：见第 A.8 章。4.9 碱处理液：见第A.9 章。4.10 尿素培养基：见第A.10 章。4.11 API 20E 生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+ 生化鉴定卡。5 检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图 1 小肠结肠炎耶尔森氏茵检验程序6 操作步骤6.1 增菌以无菌操作称取25g(或 25 mL) 样品放入含有225 mL 改良
4、磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均 质袋中，以8 000 r min 均质 l min 或拍击式均质器均质1 min 。液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。于26 l增菌 48 h72 h。6.2 碱处理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5 mL 与碱处理液4.5 mL 充分混合l5s。6.3 分离将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN-1 琼脂平板和改良Y琼脂平板， 于 26 l培养 48 h 2 h，典型菌落在CIN-1 琼脂平板上为红色牛眼状菌落，在改良 Y 琼脂平板上为无色透明、不粘稠的菌落。6.4 改良克氏双糖试验分别挑取上述可疑菌落3 个 5 个，接种改良克氏双糖斜
5、面，于26 l培养 24 h，将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。6.5 尿素酶试验和动力观察将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，于26土 l培养 2 h4 h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于26 l和36 l恒温培养箱中培养24 h。将 26有动力的可疑菌落接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色和生化试验。6.6 革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(0.8 m 3.0 m) 0.8 m。6.7 生化鉴定6.7.1 常规生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取单个菌落做生化试验，所有的生化反应皆在2
6、6 l培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特性以及与其他菌的区别见表1。表 1 小肠结肠炎耶尔森氏茵与其他相似茵的生化性状鉴别表项目小肠结肠炎耶尔森氏菌中间型耶尔森氏菌弗氏耶尔森氏菌克氏耶尔森氏菌假结核耶尔森氏菌鼠疫耶尔森氏菌动力 (26) + + + + + - 尿素酶+ + + + + - VP试验 (26) + + + - - - 鸟氨酸脱羧酶+ + + + - - 蔗糖d + + - - - 棉子糖- + - - - d 山梨醇+ + + + - - 甘露醇+ + + + + + 鼠李糖- + + - - + 注： +阳性； -阴性； d有不同生化型。6.7.2 生化鉴定系统可选择使用
7、两种生化鉴定系统(APl 20E 或 VITEK GNI+)中任一种，代替常规的生化鉴定。6.7.2.1 API 20E ：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照API 20E 操作手册进行并判读结果。6.7.2.2 VITEK 全自动细菌生化分析仪：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照VITEK GNI+操作手册进行并判定结果。6.8 血清型鉴定除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。具体操作方法按GBT 4789.4 中沙门氏菌0因子血清分型。7 结果报告综合以上生化特性报告结果，报告25g(或 25 mL) 样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。附录A (规范性附录 ) 培养基和试剂A.1 改
8、良磷酸盐缓冲液A.1.1 成分磷酸氢二钠8.23g 磷酸二氢钠1.2g 氯化钠5.0g 三号胆盐1.5g 山梨醇20g A.1.2 制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加入三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH 为 7.6，分装试管，于121高压灭菌15 min，备用。A.2 CIN-1 培养基A.2.1 基础培养基：胰胨20.0g 酵母浸膏2.0g 甘露醇20.0g 氯化钠1.0g 去氧胆酸钠2.0g 硫酸镁0.01g 琼脂l2.0g 蒸馏水950 mL pH7.5 0.1 将基础培养基于121高压灭菌15 min，备用。A.2.2 Irgasan：以95的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成0.4的溶液
9、，待基础培养基冷至80时，加入1 mL 混匀。A.2.3 冷至 50时，加入：中性红 (3 mgmL) 10.0 mL 结晶紫 (0.1 mgmL) 10.0 mL 头孢菌素 (1.5 mgmL) 10.0 mL 新生霉素 (0.25 mgmL) 10.0 mL 最后不断搅拌加入l0.0 mL 的 10氯化锶，倾注平皿。A.3 改良 Y 培养基A.3.1 成分蛋白胨15.0g 氯化钠5.0g 乳糖l0.0g 草酸钠2.0g 去氧胆酸钠6.0g 三号胆盐5.0g 丙酮酸钠2.0g 孟加拉红40 mg 水解酪蛋白5.0g 琼脂17g 蒸馏水1 000 ml. A.3.2 制法将上述成分混合，校正p
10、H7.4 0.1。于 121高压灭菌15min，待冷至 45左右时，倾注平皿。A.4 改良克氏双糖培养基A.4.1 成分蛋白胨20g 牛肉膏3g 酵母膏3g 山梨醇20g 葡萄糖1g 氯化钠5g 柠檬酸铁铵0.5g 硫代硫酸钠0.5g 琼脂12g 酚红0.025g 蒸馏水1 000 ml pH7.4 A.4.2 制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入 0.o2的酚 ETJ(溶液 l2.5 mL，摇匀，分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。l21高压灭菌15 rain ，放置高层斜面备用。A.5 糖发酵管A.5.1 成分牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠3g 磷酸氢二钠
11、2g 0.2溴麝香草酚蓝溶液12 mL 蒸馏水1 000 mL pH7.4 A.5.2 制法A.5.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内， 121高压灭菌15 min。A.5.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶l00 mL ，121高压灭菌15 min。另 将各种糖类分别配好10溶液，同时高压灭菌。将5 mL 糖溶液加入100 mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。A.5.3 试验方法从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于26 l培养， 一般观察2 d3 d。迟缓反应需观察14
12、d30 d。A.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基A.6.1 成分蛋白胨5g 酵母浸膏3g 葡萄糖1g 蒸馏水1 000 mL 1.6溴甲酚紫 -乙醇溶液1 mL L-鸟氨酸或DL- 鸟氨酸 0.5g100 mL 或 1g100 mL pH6.8 A.6.2 制法除鸟氨酸以外的成分加热溶解后，分装，每瓶 l00 mL ， 分别加入鸟氨酸。 L-鸟氨酸按0.5加入， DL- 鸟氨酸按1加人。再校正pH 至 6.8。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，ll5高压灭菌10 min。A.6.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 26 l培养 18 h24
13、h，观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。A.7 半固体琼脂A.7.1 成分蛋白胨1g 牛肉膏0.3g 氯化钠0.5g 琼脂0.35g0.4g 蒸馏水100mL pH7.4 A.7.2 制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管，121高压灭菌15 min，直立凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR 和 VP 试验用 ) A.8.1 成分磷酸氢二钾5g 多胨7g 葡萄糖5g 蒸馏水1 000 mL pH7.0 A.8.2 制法溶化后校正pH，分装试
14、管，每管1mL，121高压灭菌15 min。A.8.3 甲基红 (MR) 试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于 26 l培养 2 d5 d，哈夫尼亚菌则应在 22 25培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：l0 mg 甲基红溶于30 mL 95乙醇中，然后加入20 mL 蒸馏水。A.8.4 V-P 试验用琼脂培养物接种本培养基中，于 26 l培养 2 d4 d。哈夫尼亚菌则应在22 25培养。加入6 -萘酚 -乙醇溶液0.5 mL 和 40氢氧化钾溶液0.2 mL ，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性， 应放
15、在 36土 l培养 4 h 再进行观察。A.9 碱处理液A.9.1 0.5氯化钠溶液氯化钠0.5g 蒸馏水100 mL A.9.2 0.5氢氧化钾溶液氢氧化钾0.5g 蒸馏水100 mL A.9.3 制法将 0.5氯化钠及0.5氢氧化钾等量混合。A.10 尿素培养基A.10.1 成分尿素20.0g 酵母浸膏0.1g 磷酸二氢钾0.091g 磷酸氢二钠0.095g 酚红0.Olg 蒸馏水1000 ml. A.10.2 制法将上述成分于蒸馏水中溶解，校正pH 为 6.8 0.2。不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管为约3 mL。A.10.3 试验方法挑取琼脂培养物接种在尿素培养基，26 l培养 24 h。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
