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1、1 双歧杆菌的分离1.1 样品取出生后 20 天母乳喂养健康婴儿粪便。1.2 培养基根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal 在这方面的应用。选择使用 NPNL 培养基，在其基础上添加X-Gal。1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（ BP）成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml 的蒸馏水中，加热溶化后分装于 250ml 的三角瓶中，每瓶 90ml，121，杀菌 15min 后置4的冰箱中备用。1.2.2 选择性改良 NPNL 培养基（苏世彦）成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱
2、氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液 A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液 B 5ml 葡萄糖10g 溶液 C 50ml 乳糖3g 琼脂15g 吐温 80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121杀菌 10min，备用。溶液 A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水 100ml。溶液 B：FeSO47H2O 0.2g、MgSO47H2O 4g、MnSO44H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水 100ml。溶液 C：丙酸钠 30g、硫酸巴龙霉素 400mg、硫酸新霉素 200mg、NaCl 6g 溶于蒸馏水
3、1000ml。1.2.3 NPNL 培养基 (孙雪) 培养基成分及用量： 牛肉浸汁粉 (oxoid)3g， 蛋白胨 10g， 胰蛋白酶 5g，植胨 3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁 150ml，葡萄糖 10g，可溶性淀粉 0.5g， 溶液 A 10ml， 溶液 B 5ml， 吐温 80 1g， 盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚 -D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121，15min 高压灭菌。溶液 A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水 250ml。溶液 B： MgSO4 7H2O 0.5g， FeSO4 7H2O 0.5
4、g， NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水 250ml，硫酸新霉素 100g/ml，硫酸巴龙霉素 200g/ml，萘啶酮酸15g/ml，氯化锂3mg/ml。1.3 分离方法取成年人的粪便1g，放人含有 9ml 缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10 的稀释液，摇匀后取1ml 注人含有 9ml 缓冲蛋白胨溶液中制成1:100 的稀释液，在此基础上作10-310-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取 10-410-9稀释液用倾注法倒平板， 每个稀释液都各取1ml 分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3 个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37进
5、行厌氧培养 48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。1.4 分离培养在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50左右的选择性改良 NPNL 培养基，然后放人37的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性双歧杆菌在改良NPNL 培养基上，经过厌氧培养以后， 菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V 字型或 Y 型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为 2-80.4-0.6m，不具
6、英膜和鞭毛，无运动性。培养 48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。见图 1。将深蓝色菌落革兰氏染色后镜检， 大部分菌体呈染色不均匀、分叉形状，符合双歧杆菌的基本的形态特征。见图2。图 1 菌落形态及颜色图 2 分离出的双歧杆菌讨论311双歧杆菌为专性厌气菌, 标本采集后要避免暴露于空气中, 尽可能快地带回实验室, 不要冷冻 , 不要使用富集培养基或转移培养基。尽快用稀释液作适当稀释后接种于合适的培养基中, 置于适宜的厌氧条件下培养。312每次标本检测需用标准菌株接种相同批次的培养基,并在同一厌氧罐中进行厌氧培养, 以检测培养基的质量和厌氧环境, 以保证每次检测结果的可靠性。3
7、13培养基添加剂不宜在4保存时间太长 , 时间太长抗生素效价下降, 抑制其他细菌作用降低, 不利于双歧杆菌的选择, 每次新鲜配制为好。314双歧杆菌和乳酸菌均含有半乳糖苷酶, 我们在自制改良BS 培养基1中加入 52 溴 242 氯 232 吲哚 2B2D2 半乳糖苷 (X2Gal)作为底物, 半乳糖苷酶可分解底物 , 释放出吲哚。由于双歧杆菌的半乳糖苷酶活性比乳酸菌以及其他细菌高, 吲哚释放的数量不同 , 使双歧杆菌与乳酸菌和其他细菌菌落呈现不同深浅的颜色, 培养基平板上双歧杆菌菌落呈深蓝色 , 其他细菌一般为白色或淡蓝色2。长双歧杆菌半乳糖苷酶在Mn2+的条件下可被少量激活 , 因而在双歧
8、杆菌培养基中应加入适量的硫酸锰。据报道25 种双歧杆菌 90%以上对半乳糖呈阳性反应 3, 因此该培养基能对双歧杆菌进行较好的选择。315我们自制的改良BS 培养基除具有双歧杆菌生长必需的营养物质、维生素、微量元素外, 还添加了双歧杆菌生长因子“吡福多素”(异麦芽寡糖 ), 双歧杆菌在此培养基上能较好生长, 其他细菌受到抑制; 双歧杆菌在此培养基上形成的菌落的形态、大小与BL 培养基上形成的菌落的形态、大小无多大差别, 而颜色易与其他细菌区别。因此该培养基是大便双歧杆菌计数较好的选择性培养基。另外有文献报道， 作为缓冲体系的磷酸盐不利于菌株的冷冻保藏，限制了菌体在后期的应用效果。 NPNL 中高浓度的无机盐对人体具有潜在的危险，不适于大规模使用。其中的L-半胱氨酸盐酸盐灭菌后产生不良气味，也不利于应用于食品中。 对上述限制 NPNL 工业化应用的成分进行替换或剔除。 （长双歧杆菌 BBMN68 工业化培养基筛选）
