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1、1 实验三 猪血中超氧化物歧化酶 (SOD)的分离纯化及活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶 (SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基2O 的金属酶。它是一种酸性蛋白，对热、 pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。SOD 催化下述反应：222222OOHOH.。机体内2O 过量或不足都会对人体产生危害，SOD对过量的2O 及时清除保证2O 含量的相对平衡。本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取 SOD 并进行纯化。该实验 SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝
2、250G法测定。考马斯亮蓝250G在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。在一定范围内，溶液在595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug。SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。二、试剂与材料1试剂：ACD 抗凝剂、0.9%NaCl、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、 10mmol/LEDTA 钠盐溶液、 3 mmol/L 邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝250G标准蛋白质溶液、2器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。三、操作步骤1、SOD 提取1 取 40ml 新鲜猪血，5000r/m 离
3、心 10min，去上层血浆， 取下层红血球粘稠液。加入 2 倍体积的 0.9%Nacl 溶液清洗， 5000r/m 离心 10min，弃上层清液。2 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml，剧烈搅拌 30min，使其充分溶血。再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25 倍体积的 95% 的乙醇溶液和 0.15 倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min，4000r/m 离心 10min，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml。将清液在 65-70 度恒温水浴中进行热处理，2 15min 后取出迅速冷却至室温， 5000r/m 离心 10min 除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样 1ml。3 向粗酶
4、液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过夜，4000r/m 离心10min，弃上清液，得沉淀，加3ml 蒸馏水溶解，备用。2、SOD 活力测定1 邻苯三酚自氧化法测定取 4.5ml 50mmol/L pH8.3 磷酸缓冲液，4.2ml 蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在 25水浴中 20min，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚 0.3ml， 迅速摇匀，倒入 1cm 的比色皿，用 10mmol/LHCl 作空白，在 325nm波长下每隔 30 秒测定一次光密度值，整个操作在4min 内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自化率在0.070/
5、min 左右。2酶活力测定操作与 1类似，只是在加入邻苯三酚前需加入适量的SOD 留样液，并相应减少蒸馏水的体积。计算加酶后邻苯三酚的自化率。3 酶活力单位计算样液体积稀释倍数反应液总体积数单位活性 %50%100/)/(00AAAmlUm其中： A0为邻苯三酚自化率， Am为加酶后邻苯三酚自化率。酶原液体积单位活性总活性)(U4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250 法）标准曲线制作。取6 支具塞试管，编号，按下表加入试剂：表 1 考马斯亮蓝标准曲线加样表试剂管号1.0 2 3 4 5 6 蛋白质标准液 (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 (ml) 1.0 0.8
6、0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮 G-250(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量 (ug) 0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。在595nm下测定吸光度值，须在1h 内完成。以标准白蛋3 白为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品中蛋白质含量的测定将待测溶液 SOD 溶解， 取一支试管，准确加入 0.1ml 样品提取液，加入 0.9ml蒸馏水和 5ml 考马斯亮蓝 G-250，其余操作与标准曲线绘制相同。蛋白质含量的测定根据所得样品提取液的光密度， 在标准曲线上查得相应的蛋白质含量，计算其浓度。5 结果处理利用考马斯亮蓝 G-250 法测定每毫升酶原液蛋白质毫克
7、数。mgUmlmgmlUmgU总蛋白质总活力单位蛋白质浓度单位活力比活力 /)/(四、实验结果1、邻苯三酚自氧化率表 2 邻苯三酚吸光值随时间的变化重复数吸光值0 0.5min 1min 1.5min 2min 2.5min 3min 3.5min 4min I 0.031 0.065 0.102 0.137 0.170 0.202 0.233 0.262 0.291 II 0.035 0.073 0.109 0.143 0.178 0.210 0.240 0.271 0.300 计算得邻苯三酚自氧化率： A0I=0.065/min， A0II=0.066/min； 则 A0=0.0655/m
8、in。2、酶活力测定表 3 酶活力计算参数表提纯步骤样液体积 ul Am 反应液总体积 ml 稀释倍数酶液总体积 ml 除血蛋白上清50 0.0525 10 1 17.5 热变性后上清50 0.04675 10 1 13.5 丙酮沉淀后的100 0.033 10 1 3 从上表可知， 实验得 3 个样品 Am值为：Am1=0.0525/min；Am2=0.04675/min；Am3=0.033/min。根据公式计算得3 个样品的单位活性依次为：79.4 (U/ml) 、114.5(U/ml)、99.2(U/ml)；总活性依次为： 1389.3(U)、1545.8(U)、297.7(U)。3、蛋
9、白质含量测定表 4 标准蛋白含量与吸光值记录表4 蛋白质含量 ug 0 20 40 60 80 100 吸光值 A595 0 0.198 0.339 0.415 0.559 0.762 y = 0.0074x R2 = 0.981200.20.40.60.81050100150标准蛋白质含量 /ug吸光值吸光值 线性 ( 吸光值)图 1 标准蛋白含量-吸光值标准曲线实验测得三个样品的蛋白质吸光值分别为：0.029、0.036、0.042。根据标准曲线 y = 0.0074x 计算得蛋白质含量分别为：0.0392ug 、0.0487ug、0.0568mg/ml。4、结果汇总表 5 试验结果汇总表
10、提纯步骤酶液总体积 ml 蛋白质mg/ml 酶活性U/ml 总活性U 比活性U/mg 回收率% 纯化倍数除血蛋白上清17.5 0.039279.41389.32025.5 100 1 热变性后上清13.5 0.0487114.51545.82351.1 95.8 1.16 丙酮沉淀后3 0.056899.2297.71746.5 24.8 0.86 五、分析与讨论1 考马斯亮蓝 G-250 标准曲线的相关系数R2不够高，这和实验操作、仪器的精度等有关。不过曲线足以用来计算蛋白质的含量。2 本实验 SOD 酶原液用蒸馏水定容至15ml，而不是 10ml，这点和其他实验组有所不同，不过其他操作和结果计算都一样。3 经过 3 个步骤的提纯，酶液总体积应该越来越小、溶液蛋白质含量越来越高、酶活性越来越高、 纯化倍数越来越高， 但是本实验丙酮沉淀后酶活性降低，纯化倍数也较第二步低，猜测是操作过程引起SOD 酶的活性丧失了部分。4 本实验使用的度量仪器精密度不高，且未设置重复，误差较大。
