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1、实时定量 PCR 应用中的问题和优化方案聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、 高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具1。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR 技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR) 技术便是一种具有革命性意义的定量PCR 技术，所谓实时定量 PCR 是指在 PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来
2、即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量2。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001 年，收录在 Medline 上的以 real-time PCR 为关键词的文章就达一千多篇。 实时 PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR 技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。 另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增3,4,5 。本文将对实时定
3、量PCR 目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。实时定量 PCR 的应用现状实时定量 PCR 技术自 1996 年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA 和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域3。Giulietti 等人6对用实时定量 PCR 测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白， 它对免疫反应、 炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病， 如炎症反应、自身免疫性疾病、 移植排斥有密切的关系。由于所得到组
4、织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法 （如 ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用 PCR 定量进行基因诊断就显得十分有意义。众所周知， cDNA 微排列和差异表达PCR 技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan 等人7利用实时定量 PCR 技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。实时定量 PCR 技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增
5、强了对基因质所发生变化方面的研究。例如 Laird 和他的同事们 8建立了一种被称作 Methylight 的实时定量 PCR 方法，它能通过特异的引物和/或 Taqman 探针检测基因 CpG 岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR 的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞 9。又如 Sevall 等人10证明可以用实时定量PCR 方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman 探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交
6、效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。目前实时定量 PCR 在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA 和 RNA 病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用， 但是必须明确， 国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA （nucleic acid sequence-based amplification）的技术 11，它是一种利用电化学以光的等温PCR 反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA
7、 反极性的RNA 扩增子，分子 beacon 常用于这种技术，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。常用的热循环仪对 PCR 产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：1. PE 公司生产的 Applied Biosystem系列： (1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR 测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm 范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链 DNA 结合染料、分子 b
8、eacon 原理的分析。 一次可以测定 96 个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2 小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。(3) ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96 孔和 384 孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h 之内
9、完成 84 个 384 孔板的样本测定。2. Roche 公司生产的 Lightcycler 热循环仪，它以能装载20-25ul 的毛细硅管作为反应管进行扩增， 光源选用冷光源系统， 可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光， 并提供三个滤光片， 可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR 。由于Lightcycler 使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化， 从而能在 20-30min 内快速完成 30-40 循环，达到样本扩增的目的 12。 Lightcycler 通常使用的实验
10、材料主要是SYBRI Green I 荧光染料和 Taqman 荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler 有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32 孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。3. Bio-rad 公司生产的 iCycler iQ ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理， 可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成 96 个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。4. Strategene 公司的 MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源， 常选
11、用的实验材料包括Taqman 探针、杂交探针和分子信标（ molecular beacon ） ，其样品盘的规格有多处可供选择，包括 96 孔盘、 8 联管或单管，其程序也提供实时数据分析。5. Cepheid 公司的 Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有 16 种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号， 而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。 Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细， 所以不利于同时进行较多样品的分
12、析。6. Corbert Research 公司的 Rotor-Gene: 这种仪器与 Lightcycler 相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm 处激发荧光，绿光在530nm 波长激发荧光；具有两种样品盘（32 孔和72 孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定。荧光材料新进展为了满足实时 PCR 更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：1. 水解探针或 Taqman 探针： 这种探针用于 Taqman 分析法，它能被 DNA 合成酶(例如 Taq
13、 酶)的 53活性所降解，探针的5 端有一荧光报告基团， 3 端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光， 但随着扩增反应的进行， 5 端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5 端相结合的基团有FAM（6羧基荧光素） ,TET（四氯 6羧基荧光素） ,JOE（2，7二甲基 4，5二氯 6羧基荧光素），HEX（六氯6甲基荧光素） 或 VIC，常与 3 端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明 )或 DABCYL （4-（4 -恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸） 。相
14、较之于TAMRA ，使用 DABCYL 可以更有效的减少自发荧光信号6。目前，水解探针已被用于基因检测 13 、病毒定量 14,15 、癌细胞基因微突变检测 16 、细胞因子基因定量 17 等，其结果都具有高特异性与高敏感性。2. 分子信标 : 是一种单链 DNA 形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团 18，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET ） ，当热循环温度达到分子beacon 的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展
15、成线性分子，使得FRET 消失，报告基团发出荧光信号 19,20 。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同 DNA 序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高21,22 ，分子 beacon 已被用于突变检测 23,24 、病原体定量 25,26 、病毒检测 27和胚胎的性别判断 28，它同时出用于多重PCR 检测逆转录病毒 29。3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能30。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。 在反应的变性阶段，探针
16、的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。 同 Taqman 探针和分子 beacon相比，scorpion 能更快地发射出荧光且信号更为强烈31，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。 Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景31。4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标， 一个携带荧光供体基团， 一个携带荧光受体基团， 当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET 。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系32。 这一方法已被 Roche 公司生产的 Lightcycler 所应用，进行病原体检测33、病毒荷载量 34的测定等领域。5. SYBR Green I:
