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1、实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作. 了解葡聚糖凝胶SephadexG-25 分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术. 二、实验原理据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8 克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8 种氨基酸。本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及
2、pH 有关。分子量大的蛋白质(球蛋白 )比分子量小 (白蛋白 )易析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。脱盐的原理： 含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。G-25:1000-5000 ；G-50:1500-30000 ；G-75:3000-80000 三、实验用品仪器： 752 型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿： 5ml 试管 20 支、 50ml 烧杯 2 个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵
3、溶液、凝胶SephadexG-25 饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯 )850g，置于 1000ml 蒸馏水中，在70-80水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。四、实验步骤1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离取卵清 2mL 于试管中；加 2mL 的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置 2 分钟；3000r/min,离心 5 分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000) ，加蒸馏水定容至4mL 溶液。取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL 溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g） ；3000r/min ，离心5 分钟；沉淀为
4、卵清白蛋白(M43000) ，加蒸馏水定容至4mL 溶液。2、 凝胶柱层析 （重点讲解，不安排做试验）(1) 凝胶柱的准备：sephadexG-25 沸水溶胀30 分钟，倾泻法倾去悬浮的小颗粒，湿装法装柱。(2) 加样和洗脱：先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚与凝胶表面相切，用枪吸取 1mL 样液沿着管壁加入柱子上方，再加3mL 蒸馏水，开始脱盐，每管收集2mL 共 15管。(3)收集和测定： 280nm 紫外吸收测定蛋白质含量或者用考马斯亮蓝法在在595nm 波长测吸光度值。(4)以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线，将蛋白质溶液收集待用。（5）将每管的洗脱液取出1ml，加入几滴BaCl2溶液，观察是否有沉淀，以此判断脱盐是否完全。五、 数据结果与分析（1）数据记录与分析鸡蛋清蛋白称量项数据记录与分析卵球蛋白离心管质量 /g 卵球蛋白与离心管质量/g 卵球蛋白质量 /g 卵清白蛋白离心管质量 /g 卵清白蛋白与离心管质量/g 卵清白蛋白质量/g （2）绘制洗脱曲线0612182430364248546000.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053卵清白蛋白的分离和脱盐-0.200.20.40.60.81020406080体积A-595系列1do
