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1、个人整理 Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面） 螺旋网1、 丙烯酰胺和 N，N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配 制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚 甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重 新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，
2、室温保存。 3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混合，加水 稀释到 100ml 终体积。过滤后 4C 保存。 4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 4C 保存。这两种缓冲液必须使 用 Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL。 5、 TEMED 原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚
3、合。PH 太 低时，聚合反应受到抑制。AP 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制. 6. 10%过硫酸铵溶液： 称取 1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至 10ml，分装到 1.5ml 微 量离心管中，冻存。 7、 SDS-PAGE 加样缓冲液:在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100g。 8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml， 临用前稀释 10 倍。PH8.3 9、 转移缓冲液： 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS（可不加）
4、 ，200ml 甲醇（临用前 加） ，加水至总量 1L。 10、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时 上述储存液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液。使用后应予以废弃。 11、 脱脂奶粉 5%(w/v)。 12、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液： 分离胶 12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml 超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml 30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml pH8.8、1.5mol/
5、LTris 溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml 超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml 30%丙烯酰胺溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml pH6.8、1.0mol/LTris 溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 ml TEMED 0.002 ml 0.004
6、ml 0.006 ml10%过硫酸铵 0.02ml 0.04ml 0.06ml一配胶 1 注意一定要将玻璃板洗净，最后用 ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的 纸巾晾干。 2 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外） ，过滤后作为储存液避光存放于 4， 可至少存放 1 个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存 液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸 3 分钟） ，加入 10%AP（0.70.8:100, 分 离胶浓度越高 AP 浓度越低，15%的分离胶可用到 0.5:100）及 TEMED（分离胶用 0.4:1000, 15%
7、的可用到 0.3:1000，浓缩胶用 0.8：1000）即可 3 封胶：灌入 2/3 的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时可用 0.1%的 SDS 封，浓度10%时 用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0.1%的 SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液 倒掉，如用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净，然后加少量 0.1%的 SDS，目的是通过降 低张力清除残留水滴。 4灌好浓缩胶后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳 孔变形。拨出梳子后用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用 0.1%的 SDS 封胶。若上样 孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；
8、若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入 梳孔后加水拔出。30min 后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其 内部分子的排列尚未完成。二样品处理 1培养的细胞（定性）： 去培养液后用温的 PBS 冲洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落） 。 对于 6 孔板来说每孔加 200300l，6080的 1loading buffer。 100，1min。 用细胞刮刮下细胞后在 EP 管中煮沸 10min，期间 vortex 23 次。 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将 EP 管置于 0后在 1400016000g 离心 2mi
9、n，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠， 可通过使用 1ml 注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 待样品恢复到室温后上样。 2培养的细胞（定量）： 去培养液后用温的 PBS 冲洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落） 。 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 1020min。 用细胞刮刮下细胞，收集在 EP 管后超声（100200w）3s，2 次。 12000g 离心，4，2min。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loading buffer 后直接上样最好，剩余 溶液（溶于 1loading buffer）可以低温储存，-70一个月，-
10、20一周，4 12 天， 每次上样前 98，3min。 3组织： 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每 50100mg 加 1ml 裂解液，肺 100200mg 加 1ml 裂解液。 可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 12000g 离心，4，2min。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loading buffer 后直接上样最好，剩余溶 液（溶于 1loading buffer）可以低温储存，-70一个月，-20一周，4 12 天，每 次上样前 98，3min。三电泳 1上样前将胶板下的气泡赶走。 2所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的
11、1loading buffer 上样， Marker 也用 1loading buffer 调整至与样品等体积。 2以初始电压为 45V 时的电流强度进行稳流电泳，当电压达 65V 时改为稳压电泳。 3在目的蛋白泳动至距胶下缘 1cm 以上结束。四转膜 1电泳结束前 20 分钟左右戴上手套开始准备： 湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至 1,000ml。干 转则取此转移液，每 50ml 加入 10%SDS180ul。 浸泡 NC 膜：将 NC 膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排 除气泡，随后浸泡入
12、转移液中。PVDF 膜则在 M-OH 中浸泡 20min 以上后转入转移液中。将滤 纸也浸入转移液中。 2取胶： 将胶卸下，保留 30-100KD 或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白） ，左上 切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧 三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3转膜： 湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入 1,000ml 电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电 转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合 物中。恒流 100mA 过夜，或 400m
13、A，4h。注意不同蛋白的要求不同。 干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以 1.5mA/cm2 凝胶面 积转移 1-2 小时。负载电压不宜超过 1V/cm2 胶面积。五封闭及杂交 1封闭： 将膜从电转槽中取出，去离子水与 PBST 或 TTBS 稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。 必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。 2结合一抗： 一抗的准备：使用反贴法时每张 39cm2 膜约需 2ml 一抗稀释液。 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑
14、料膜上，将 Western 膜从封闭液中取出，滤 纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或 4静 置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3洗涤： 一抗孵育结束后，用 PBST 或 TTBS 漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。 4结合二抗： 根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择 HRP 或 AP 标记的抗体，按相应比例稀释 （1:10001:10000） ，室温轻摇一小时。5洗涤： 二抗孵育结束后，用 PBST 或 TTBS 漂洗膜后再浸洗三次，每次 5-10min。六发光鉴定 一般使用辣根过氧化物酶 HRP-ECL 发光法或碱
15、性磷酸酶 AP-NBT/BICP 显色法。 1HRP-ECL 发光法： 将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固 定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显 影液中 1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定 Marker，进行分析与扫描。 2AP-NBT/BICP 显色法： 每片 NBT/BICP 可溶解于 30ml 水中，使用前将一片分装在 30 个 EP 管中，每张 39cm 的膜 取一
16、管配成 1ml 即可。将 PBST 或 TTBS 洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反 贴法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色 20s 后每 10s 观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察 与扫描。七增强敏感性 若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度： 1 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。 2 将膜在 PBST 或 TTBS 中洗涤 30min 或更长，期间至少换 2 次液。 3 封闭 4060min 4 一抗杂交，室温 1h。37 1h 会更强，但可能增加非特异条带。 5 PBST 或 TTBS 洗膜 20min，期间换 2 次液。 6 二抗杂交，37 1h。 7 PBST 或 TTBS 洗膜 20min，期间换 2 次液。
