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1、第 1 页 共 4 页实验九水中总大肠菌群的测定多管发酵法一实验目的和要求 1掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。 2预习第六章细菌学检验法的关内容。 二原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌 群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关 特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数 （most probable number ） ，简称 MPN 表示。 三仪器 (1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、镍铬丝接种棒。 (5)培养皿（直径 100mm） 、试
2、管（ 5150mm） ，吸管（ 1、5、10mL） 、烧杯 （200、500、2000mL） 、锥形瓶（ 500、1000mL） 、采样瓶。 四培养基及染色剂的制备 1乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g乳糖和 5g氯化钠加 热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙 醇溶液 1mL，充分混匀，分装于试管中，于121高压灭菌器中灭菌15min，贮 存于冷暗处备用。 2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液： 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。 除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。 3品红亚硫酸钠培养基： 贮备培养基的制备：于2000m
3、L 烧杯中，先将2030g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨，混匀，使其溶 解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液 pH 为 7.27.4。趁热用脱脂棉或绒 布过滤，再加入 10g乳糖，混匀，定量分装于250mL 或 500mL 锥形瓶内，置于 高压灭菌器中，在121灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。 平皿培养基的制备： 将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培 养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌 试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌试管内， 加灭菌水少许使其 溶解，再置于沸水浴中
4、煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠 溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。将 此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即 将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内 备用，但保存时间不宜超过两周。 如培养基已由淡红色变成深红色， 则不能再用。 4伊红美培养基： 贮备培养基的制备：于2000mL 烧杯中，先将2030g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解。再家人2.0g 邻酸二氢钾及10g 蛋白胨，混合使之溶解， 用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液 pH 值为 7.27.4。趁热用
5、脱脂棉或绒布过 滤，再加入 10g乳糖，混匀后定量分装于250mL 或 500mL 锥形瓶内，于 121 高压灭菌 15min，贮于冷暗处备用。第 2 页 共 4 页平皿培养基的制备： 将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基 的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2% 伊红水溶液（ 0.4g 伊红 溶于 20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（ 0.065g 美蓝溶于 13mL水 中） ，加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀 （防止产生气泡），立即将此培养 基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。 5革兰氏染色剂： 结晶紫染色液：将20mL 结晶紫乙
6、醇饱和溶液（称取48g 结晶紫溶于 100mL95% 乙醇中）和 80mL 1% 草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉 淀，不能再用。 助染剂： 将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后， 加入少许蒸馏水， 充分振荡， 待完 全溶解后，用蒸馏水补充至300mL 。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡 黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前 再加水稀释。 脱色剂： 95% 乙醇。 复染剂：将 0.25g 沙黄加到 10mL95% 乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸 馏水。 五测定步骤 1生活饮用水： 初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培
7、养液的大 试管或烧瓶中（内有倒管） ，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL 。在 10 支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌 操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于 37恒温箱内培养 24h。 平板分离： 上述各发酵管经培养24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管 分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37恒温箱内培养 24h，挑选符合下列特征的菌落： a伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或 略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 b品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带 或略
8、带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。 取上述特征的群落进行革兰氏染色： a用以培养 1824h 的培养物涂片，涂层要薄； b将涂片在火焰上加温固定， 待冷却后滴加结晶紫溶液， 1min 后用水洗去； c滴加助色剂， 1min 后用水洗去； d滴加脱色剂， 摇动玻片， 直止无紫色脱落为止 （约 2030s） ，用水洗去； e滴加复染剂， 1min 后用水洗去， 晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌， 呈红色者为阴性菌。 复发酵试验： 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选 该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管）， 每管可接种分离自同一初发酵管（
9、瓶）的最典型菌落13 个，然后置于 37恒 温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证 实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠 菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。 2水源水 于各装有 5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管） ，分第 3 页 共 4 页别加入 10mL水样；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管）， 分别加入 1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒 管） ，分别加入 1mL 110 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混 匀，置于 3
10、7恒温箱内培养24h。 平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2“最可能数（ MPN ）表” ， 即求得每 100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故 MPN 值再乘以 10，即位 1L 水样中的总大肠菌群数。 例如，某水样接种 10mL的 5 管均为阳性； 接种 1mL的 5 管中有 2 管为阳性； 接种 110 的水样 1mL的 5 管均为阴性。 从最可能数（MPN ）表中查检验结果5 20，得知 100mL水样中的总大肠菌群数为49 个，故 1L 水样中的总大肠菌群数 为 4910=490个。 对污染严重
11、的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做110、1100、 11000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。 如果接种的水样量不是10mL 、1mL和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的 水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL的 MPN 值：)()(10mLmLMPNMPN 接种 量最大 的 一管指 数值附表 1 大肠菌群检数表接种水样总量300mL （ 100mL2份， 10mL10份）10mL水量的阳性管数100mL水量的阳性瓶数 0 1 2 1L 水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
12、230 第 4 页 共 4 页附表 2 最可能数（ MPN ）表（接种 5 份 10mL水样、 5 份 1mL水样、 5 份 0.1mL 水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95% 可信限值）出现阳性份数每 100mL水样中细菌数的最可能数95% 可信限值出现阳性份数每 100mL水样中细菌数的最可能数95% 可信限值10mL管1 mL管0.1 mL管下限上限10mL管1 mL管0.1 mL管下限上限0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 2 3 0 0 1
13、 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 17 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 34 43 33 46 63 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 3 5 5 7 9 7 9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 7 7 11 7 11 15 15 15 13 46 46 31 46 46 63 78 67 78 80 93 93 70 8
14、9 110 93 120 150 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600 2400 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640 17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 130 170 220 190 250 310 500 300 190 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800
