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1、l t 凼坍和医科大学t l - 幽医学科学院博士学位论文中文摘要功能性抗体库技术分离鉴定肺癌功能性基因的研究博士研究生：陈立钊导师：杨治华中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所( 肿瘤医院)细胞及分子生物学实验室肺癌是严重威胁人类生命与健康的恶性肿瘤，发病率、死亡率均位居第一位。目前治疗肺癌的三大手段仍未能显著降低肺癌的死亡率。分子靶向治疗在临床肿瘤治疗中显示出良好的应用前景，也是目前肿瘤研究的热点。实现分子靶向治疗的前提和关键是获得肿瘤特异表达的功能性靶分子、靶基因。为此，本文采用大容量功能性抗体库技术筛选肺癌功能性单抗，再通过功能性抗体分离鉴定肺癌功能性基因。并探讨功能性基因在肺癌发生
2、发展中所起的作用功能及其分子作用机理。从而为肺癌的靶向治疗提供有价值的分子靶标。第一部分功能性单抗库技术筛选分离、鉴定肺癌功能性抗原基因采用新鲜肺癌组织分离的有核细胞免疫B A L B c 小鼠，融合制备库容为14 4 0 个克隆的肺癌功能性单克隆抗体库。免疫细胞化学筛选获得3 7 7 株稳定分泌抗人肺癌细胞单抗的杂交瘤，通过肺正常组织的免疫组化实验，排除2 7 1 株与正常肺组织阳性反应的单克隆抗体，获得1 0 6 株识别肺癌组织中抗原的表达高于正常肺组织表达水平的功能性单抗。肺癌及其J 下常肺组织的配对组织芯片检测证实6 7 株单抗与肺癌组织呈强阳性反应，而与F 常肺组织不反应或弱反应。这
3、些单抗识别的抗原有表达于细胞膜的，也有表达于胞浆和或胞核的。M T T 法测定1 0 6 株肺癌单抗对肺癌细胞增殖生长的影响，发现抑制肺癌细胞增殖生长的单抗5 7 株，其中，抑制率大于2 0 的单抗有2 4 株，抑制率在1 5 2 0 的单抗2 2 株。R T C E S l ”系统实时观察1 0 6 株单抗对肺癌细胞生长的影响，结果显示4 9 株单抗能够显著抑制肺癌细胞的生长，其中1 6 株单抗抑制率在2 0 以上，2 0 株单抗抑制率在1 5 2 0 ，其余单抗抑制率在1 0 一1 5 。1 0 6 株单抗的亚类分析证明既幽协和医科大学一l - 医学科学院博十学位论文有不同的重链类和亚类(
4、 I g M ，I g A ，I g G l ，I g G 2 a 及I g G 2 b ) ，也有不同的轻链型( 1 c ，九) ，表明本研究制备的功能性单抗库有很好的多样性。挑选2 7 株功能单抗进行了裸鼠体内移植瘤抑制实验，结果证实2 3 株单抗在裸鼠体内能显著抑制肺癌的生长和瘤重，其中6 株单抗体内抑瘤率在7 0 以上，8 株单抗抑瘤率在5 0 7 0 ，另外6 株单抗抑瘤率在3 0 5 0 ，其余3 株抑瘤率在3 0 以下，这些结果也提示功能性单抗所识别的抗原基因是功能性基因，具有促进肺癌细胞增殖生长功能。选取其中的5 株功能性单抗分离鉴定其功能性抗原蛋白，运用免疫亲和层析和M A
5、L D I T O P P M F 质谱技术鉴定获得了3个肺癌功能基因。单抗1 E 2 识别的抗原基因为氨甲酰磷酸合成酶I ( C P S l ) ，5 8 8 抗体识别的抗原基因为理阿诺碱受体1 ( R y R l ) ，1 3 H 3 抗体所识别的抗原基因为凝集素半乳糖苷结合可溶3 结合蛋白基因( L G A L S 3 B P 或者M a c 一2 B P ) 。第二部分肺癌抗原M a c 2 B P 基因功能的研究文献报道M a c 一2 B P 在大部分肿瘤组织高表达，但是关于M a c 一2 B P 在肿瘤发生发展中所起的功能作用却很少有研究报道。因此，以M a c 一2 B P
6、为研究对象，进行多种功能实验研究，揭示M a c 一2 B P 基因在肺癌发生发展中的功能作用及其在临床疾病研究方面的应用价值。采用基因敲降及免疫共沉淀技术验证质谱鉴定结果，证明肺癌功能单抗1 3 H 3 识别的抗原基因确实为M a c 一2 B P 。应用细胞免疫荧光和免疫细胞化学实验证实M a c 一2 B P 在多种肺癌细胞有较高水平的表达。免疫组化分析1 0 5 例肺癌病人癌组织及其配对正常肺组织M a c 一2 B P 基因的表达，发现M a c 一2 B P 在肺癌组织的表达显著高于正常肺组织，同时还发现M a c 一2 B P 的表达水平与肺癌患者的癌组织分化程度具有显著相关性，
7、这些结果提示M a c 一2 B P 可作为一种新的肺癌分子标志物，具有临床诊断及预测病人预后状况价值。应用抗体1 3 H 3 检测分析M a c 一2 B P 基因体外对肺癌细胞增殖、粘附及侵袭迁移功能的影响，未观察到阳性结果，其原因可能是M a c 一2 B P 在所检肺癌细胞体外培养分泌表达蛋白水平及含量太低所致。应用纯化后抗体再次进行体内抑瘤实验，评估抗体对肺癌生长的影响，1 3 H 3 单抗能显著抑制肺癌移植瘤生长，且具有剂量依赖关系。结果发现其高、中、低剂量的抑制率分别为6 0 1 4 、5 4 8 6 和4 3 8 4 ，进一步证明1 3 H 3 是功能性肺癌单抗，M a c 一
8、2 B P 基因是肺癌功能性基因，它能促进肺癌的增殖生长。为了从基因水平进一步证明M a c 一2 B P 表达在肺癌细胞生长的促进作用，采用R N A i干扰技术敲降肺癌细胞M a c 一2 B P 基因的表达，检测基因敲降前后肺癌细胞增殖、粘附2I | I 幽协和医科大学叫l 陶医学科学院博十学位论文及迁移侵袭的变化。结果证明M a c 一2 B P 基因敲降后肺癌细胞的增殖能力降低3 8 5 ，肺癌细胞与胞外基质c o l l a g e nI 的粘附降低4 0 ，与m a t r i g e l 粘附降低5 0 9 6 ，与F N 粘附水平减少3 5 以上，肺癌细胞体外迁移和侵袭能力分
9、别下降2 7 和2 9 。应用稳转s h R N A 敲降M a c 一2 B P 基因表达的体外功能实验研究也获得了相似的结果。同时，体内抑瘤实验研究结果也表明M a c 一2 B P 基因敲降后，肺癌细胞在裸鼠体内的增殖生长能力显著降低，其对瘤重的抑制率高达8 0 。基因敲降的体内外功能实验研究再次证明M a c 一2 B P是个具有促进肺癌细胞生长增殖、促进与胞外基质粘附和迁移侵袭功能的功能性基因。为了探讨M a c 一2 B P 促进肺癌生长增殖的作用机制，我们测定了M a c 一2 B P 基因敲降后对肺癌细胞细胞周期变化的影响。研究结果发现该基因敲降后，肺癌细胞发生G 1 期阻滞，
10、致使增殖减慢，进一步研究发现M a c 一2 B P 基因敲降后，抑癌基因p 2 7 诱导上调表达。这表明M a c 一2 B P 基因通过调节P 2 7 蛋白水平，影响细胞周期进程，从而促进肺癌细胞在体内外的快速增殖和生长。因此该基因具有作为肺癌靶向治疗的一个新的功能性分子靶标的潜力。3l I I 防和医科大学I 幽医学科学院博十学位沦文A b s t r a c tS c r e e n i n ga n dI d e n t i f i c a t i o no fL u n gC a n c e rF u n c t i o n a lI ：k n e sb yF u n c t i
11、o n a lM o n o c l o n a lA n t i b o d yL i b r a r yP h D S t u d e n t ：C h e nL i z h a oS u p e r v i s o r ：Z h i h u aY “gD 印a n m e n to f C e U 锄dM o l e c u l a rB i o l o g MC a n c e rI n s t i t u t e ( H o s p i t a l ) ，P e k h 玛U n i o nM e d i c a lC o l l e g ea 1 1 dC h i l l e s
12、eA c a d e m yo f M e d i c a lS c i e n c e s ，B e i j i n g1O 0 0 2l ，C h j I l aL u n gc a I l c e ri So n eo ft h em o s tc o m m o nI n a l i g n a n c i e sw o r l d w i d e 、v i t hh i g h e s ti 1 1 c i d e n c e锄dm o r t a l i t yr a t e H o w e V e r ，t h et r a d i t i o n a lc u r a t i
13、V em e t h o d sh a V eo n l yl i m “e de 丘e c to nr e d u c m gt h eI n o r t a l i t yo fl u n gc a n c e r P r e s e n t l ym ol e c u l a rt a r g e tt h e r a p ys h o w s 黟e a tp r o m i s emc l i I l i c a l t r e a t m e n to fc 锄c e r 锄db e c a m eo n eo ft h eh o tr e s e a r c hf i e l d
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15、 o d yl i b r a r ys c r e e n m gt e d m i q u ew a Se m p l o y e d ，a 1 1 dt h e nt h e 如n c t i o n a lg e n e sw a si s o l a t e db yt h e 如n c t i o n a la n t i b o d i e s W et h 肌s t u d i e dt h ef I l n c t i o n a l r e l e V a n c eo f t h e s eg e n e si I lt h ed e V e l o p m e n to
16、 fl u n gc a n c e r 锄dt h eu n d e r l y i n gm 0 1 e C u l a rn l e c h a n i sm P a r t l S c r e e n i n ga n di d e n t i l r i c a t i o no fl u n gc a n c e rr e l a t e df u n c t i o n a Ig e n e s b yf h n c t i o n a lm o n o c l o n a la n t i b o d yl i b r a r yB A L B cm i c ew e r ei m 枷n i z e dw i t hc a n c e r o u sc e l I si s ol a t e d 行o m 仔e s hh u m a nl u n gc a J l c e rt i s s u e T h es p l e e nc e l l sw e r e
