《CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝疫苗弱无应答中的作用及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CD4+CD25+调节性T细胞在乙肝疫苗弱无应答中的作用及机制研究（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三军医大学硕士学位论文C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞在乙肝疫苗弱无应答中的作用及机制研究摘要乙型肝炎病毒( h 印a t i t i sBv i m s ，船V ) 是一种非细胞毒性D N A 病毒，侵入机体后可引发特异性免疫反应，引起肝脏的急性或慢性病理损伤。据世界卫生组织统计，目前全球将近有3 5 亿乙肝病毒携带者，每年约有 2 5 万人死于乙肝病毒感染的相关疾病，而且这种死亡率正逐年增加。因此，针对乙肝病毒有效的免疫疗法是全世界关注的热点问题。我国是一个乙肝大国，有许多人正遭受着乙肝病毒的困扰，要做到有效地控制乙肝病毒感染，首先要做好预防工作。近2 0 年来，对于预
2、防乙肝病毒最有效和传统的路线就是注射保护性的乙肝表面抗原疫苗。但是，据调查统计在按照常规的O 、1 、6 月程序对健康者进行全程免疫之后，仍会有5 1 0 的接种者抗体始终阴性或达不到保护阈值( 抗体滴度 2 5 0 ，O O Op e o p l ed i ee a c hy e a r6 0 【I lH B V - r e l a t e d1 i V e rc i n h o s i sa 1 1 dh 印a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a T h ed e V e l o p m e n to fa n t i V i r a la I l d
3、i m m u n o t h e r a p i e sf o rH B V i n f e c t e dp a t i e n t st h e r e f o r er e m a i n sa ni m p o r t a n tp r i o r i t ) r C h i n ai sab i gc o u n 臼yw i m 趾i I l c r e a u s e di n f c c t i o no fH B V ，m a n yp e o p l ea r es u f f e r h l gt h ep u z z l eo ft h i sV i m si I l
4、f e c t i o n S of o rm es a k eo fe f f e c t i V e l yc o 蛐1V i n l ss p r e a d i n ga b r o a d ，p r e c a u t i o ns e e m sV e r ) ri n l p o r t a n tn o w F o rn e a r l y 帆od e c a d e s ，p r o t e c t i V eV a c c i n e sm a ta g a i n s th 印a t i t i sBV i m si n f e c t i o nh a v eb e e
5、 na 血l i n i s t e r e dr o u t i n e l ya I l dm ea n t i b o d i e st ot h eh 印a t i t i sBs u r f a c ea n t i g e n ( 船s A 曲t h e ye l i c i ta r ec l e 砌ye f f e c t i V ei np r e v e n t i n g 协f e c t i o n s w i m 船V H o w e v e r ，b a s e ss t a t i s t i c a li n V e S t i g a t i o n 心e r
6、s t a I l d a r di m m u n i z a t i o nt h e r ei ss t i l la b o u t5 1O o fh e a l t h yV a C c i l l er e c i p i 朗t sf a i lt op r o d u c ep r o t e c t i V e1 e v e l so f 锄t i b o d i e s( d e f i n e da sa na n t i b o d yl e v e l 2 5 万人死于与邱V 感染相关的疾病【l 】。目前对于预防乙肝病毒感染最有效和传统的路线就是注射保护性的乙肝表面抗原
7、疫苗，并且乙肝疫苗的安全性、免疫原性和预防乙肝病毒感染上的良好的保护效果已得到国内外学者的充分肯定。但是，据统计自从上世纪8 0 年代应用乙肝疫苗以来，不管是血源疫苗还是重组基因疫苗，在按照常规的0 ，1 ，6 月程序对健康者进行全程免疫之后，仍然有5 1 0 的接种者抗- H B s 始终阴性或达不到保护阈值【2 7 】，表现为弱应答或无应答，这类人重新成为乙肝病毒的易感者，这种现象被称为乙肝疫苗免疫失败。许多学者经过多年的研究，证实乙肝疫苗免疫失败与众多因素有关，如疫苗本身的抗原纯度、疫苗的剂量，疫苗的接种部位、接种途径，以及接种者的年龄、性别等有关。但是在消除了上述因素之后，乙肝疫苗免疫
8、失败免疫失败的现象仍无法避免。后来，有人提出这种无应答现象是否是由于体内的A P C 细胞功能缺陷不能够有效地捕获、加工和递呈皿s A g 或者是由于B 7 共刺激分子的表达缺陷而导致机体免疫应答 下调以及舳s A g 抗原特异性的T 细胞克隆丢失，但是这一系列假设在后来的实验中都逐一被否定了瞵 9 】。自1 9 9 5 年日本学者S a l 【a g u c h i 等发现在C D 4 + T 细胞中有一群持续表达C D 2 5 + 的T细胞亚群【l o 】，并且这群细胞具有低反应性和免疫抑制性，自此有关C D 4 + C D 2 5 + T 细胞的研究得到迅猛发展，现已逐步证实它具有抑制自
9、身反应性T 细胞、阻止自身免疫性疾病的发生、维持自身免疫耐受等功能，并视其功能将C D 4 + C D 2 5 + T 细胞作为调节性T 细胞或抑制性T 细胞的代名词( T r e g ) 。关于T r e g 的来源尚未完全明确，目前有两种理论假设。一种认为T r c g 产生于胸腺，成熟于特定的细胞系【1 0 ，1 1 】；另一种理论认为T r e g 代表正常C D 4 + T 淋巴细胞的一种特殊分化状态，即任何一种C D 4 + T 细胞在特定的微环境中，如有相应的抗原刺激，都有可能分化成T 调节细胞。“胸腺发生”理论的依据包括：( 1 ) 胸腺中成熟C D 4 + T 细胞中也存在5
10、 l O第三军医大学硕士学位论文1 0 的T r e g ，其表面标志和功能与外周淋巴组织中T 调节细胞相似【lu ，1 1J ；( 2 ) 如将新生小鼠的胸腺在生后第三天切除，其体内的T r e g 会显著降低，尽管随着时间的延长，其T 细胞数量会部分恢复。然而该理论难以解释的是，为什么这群T 调节细胞会表达许多与T 细胞激活有关的分子抗原如C D 2 5 、G I T R 、C T L A 2 4 ，而C D 4 5R B 等表达会下降，而同在胸腺成熟的C D 4 + C D 2 5 。T 细胞却不表达上述抗原或分子? 因此，人们开始研究是否外周淋巴组织可以诱导产生T r e g 。有实验
11、室研究发现，正常小鼠胸腺的C D 4 + C D 2 5 纯真T 细胞，在体外T C R 和T G F D 的共同刺激下，可以转化为T r e g ，其表面标记及功能与天然T r e g极为相似 1 2 】。此发现已被许多其它研究者证实。这一发现的意义在于不仅挑战过去的“胸腺发生”理论，提供了支持T r e g 为特殊分化状态理论的实验根据，并且为临床应用T r e g 提供了实验手段和操作技术。目前已有许多研究证实，控制T r e g 产生和转化的最重要的基因是F O 3 。转录因子F O x P 3 的发现并被许多研究者证实其编码基因是调控T r e g 发育和T r e g 抑制功能的主
12、要控制基因，并发现将F O X P 3 基因通过逆转录病毒转染，可使脾脏的初始T 细胞转变为C D 2 5 + T 细胞，说明F O X P 3 能直接或间接诱导T r e g 相关分子的表达。在外周血中，C D 4 + C D 2 5 + T r e g 持续表达F O ，3 ，而C D 4 + C D 2 5 的T 细胞不表达或仅微弱表达F O X P 3 ，因此可将其作为判断T r e g 细胞的一个金标准【1 3 1 7 1 。T r e g 细胞在自身免疫性疾病、肿瘤和器官移植方面目前研究比较深入，已经证实它能够通过抑制其他C D 4 + T 细胞和C D 8 + T 细胞的活化和增
13、殖来抑制机体的免疫应答【1 8 硒】。有研究报道，在慢性乙肝患者体内检测到一群持续升高比例的T r e g ，并且这群皿V 特异性T r e g 能够通过抑制C D 8 + T 细胞的增殖而下调机体抗病毒免疫，从而导致慢性感染【2 8 1 。在2 0 0 4 年有研究报道发现在人的淋巴器官扁桃体中，T r e g 细胞可以在趋化因子的作用下，移行至扁桃体生发中心( G C ) ，通过抑制G C T h 细胞，而下调生发中心T h 依赖的B 细胞抗体应答【2 9 3 0 1 。并且，还有研究发现对于T h 2 细胞所介导的呼吸道反应性炎症，C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞发挥了
14、强大的抑制作用【3 1 1 ，C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞通过抑制T h 2 类细胞因子如也4 的产生进而缓解呼吸道反应性炎症。C D 4 + C D 2 5 +调节性T 细胞不但可以抑制T h l 细胞，还可以抑制T l l 2 细胞应答，并且对后者的作用更强【3 2 】，如果移除C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞，则可以增强效应性C D 4 + T 细胞的T h O 向T h 2 极化，从而强化效应细胞的免疫应答。T r e g 细胞的发现，其重要意义在于它是维护正常免疫耐受的重要机理之一。此类细胞的数量和功能变化和许多与免疫相关疾病的发生、发展有关，
15、因此根据不同的疾病，可以人为地调节、纠正和控制此种调节性T 细胞的数量、功能，以达到预防和治疗相应第三军医大学硕士学位论文疾病的目的。基于以上的研究背景，我们提出假设，乙肝疫苗弱无应答现象是否与T r e g 细胞相关，在乙肝疫苗弱无应答者体内T r e g 频率是否上调；而且这群T r e g 细胞是否具有船s A g抗原特异性，并且能够抑制其它T 淋巴细胞的活化和增殖；从弱无应答者C D 4 + C D 2 5 。的细胞群中能否重新诱导出一群新的H B s A g 特异性C D 4 + C D 2 5 十的T 细胞，并且这群新诱导出的细胞是否表达T r e g 细胞的特异性标志物一O X
16、P 3 ；并且证实在弱无应答者 体内T r e g 细胞是否能够通过抑制T h 2 细胞的极化及，I 1 1 2 本身活化而影响T l l 2 依赖的B细胞抗体应答，从而导致机体的这种抗体弱无应答现象的发生。因此，我们通过流式细胞仪技术检测了乙肝疫苗弱无应答者外周血中的T r e g 频率，通过R T P C R 技术检测了其P B M C 中F 0 ，3 的m R N A 表达情况，以判断弱无应答与T r e g 的相关性；通过用H B s A g 再次在体外诱导弱无应答者P B M C ，以强应答组作为对照，用C F S E 染色的方法检测两组的P B M C 的增殖情况，以判断T r e g 细胞的抑制作用， 通过流式细胞术检测两组P B M C 经皿s A g 诱导后T r e g 频率是否上调，并且用霍乱毒素作为对照，以证明它的抗原特异性；通过磁珠分选剔除弱无应答者外周血T r e g 后，看是否能够从C D 4 + C D 2 5 。的T 细胞中重新诱导出一群新的H
