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1、中国协和医科大学硕士学位论文脂质体药物和生物佐剂在肿瘤治疗中的研究姓名：张永明申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：马洁20080501北京协和医学院硕士研究生论文张永明脂质体药物和生物佐剂在肿瘤治疗中的研究引言目前，随着我国人口持续增长和人口老龄化的加剧，以及生活方式改变和经济与环境因素的影响，自上世纪七十年代以来，我国恶性肿瘤死亡率呈明显上升趋势。根据现有的资料显示，恶性肿瘤已成为我国城乡居民的首要死因，极大的危害了广大人民群众的健康。如何有效控制肿瘤无疑已成为现今肿瘤临床和基础研究人员的重点攻关课题。目前，临床肿瘤治疗手段多种多样，但有效的药物治疗方法还有待提高。另一方面，如何调动机体
2、自身的抗肿瘤免疫反应也逐渐成为人们研究的热点领域。本论文从脂质体药物和联合应用免疫佐剂两种肿瘤治疗方法中较新颖的方面探讨有效治疗肿瘤的途径，为肿瘤治疗的临床应用做基础性研究方面的铺垫。一、聚乙二醇修饰的脂质体药物。脂质体( L i p o s o m e ) 是一种由排列有序的脂质双分子层组成的多层微囊，具有类似生物膜的近晶型液晶结构，于1 9 6 5 年问世并得名，并在1 9 7 2 年首次用于药物载体。尤其作为治疗肿瘤药物的载体具有很多优势：( 1 ) 可减轻被包裹药物的毒性，或改变药物的分布，有效延长药物在体内的停留时间，减少清除率。( 2 ) 通过脂质体的被动靶向作用提高肿瘤组织中药物
3、浓度，提高杀死肿瘤细胞的作用，同时降低对正常组织的毒副作用。尤其采用聚乙二醇修饰的脂质体，即长循环脂质体，能有效防止网状内皮系统吞噬作用，可以更加有效的提高肿瘤治疗的效果。( 3 ) 脂质体表面还可经抗体或小分子物质等多种修饰，可作为主动靶向给药的良好载体。二、生物佐剂的联合应用。佐剂( A d j u v a n t s ) 的引入可有效调节机体的免疫反应，增强机体免疫系统对肿瘤相关抗原的反应性。具有免疫刺激活性的含有未甲基化C p G 基序的寡脱氧核苷酸( C p GO D N ) ，及人工合成的双链R N A 的类似物P o l y ( I ：C ) ，能够分别与细胞内t o l l 样
4、受体9 和t o l l 样受体3 结合，作为免疫调节剂，刺激机体固有免疫反应的增强。如果联合肿瘤相关抗原，如M U C l 粘蛋白，可有3北京协和医学院硕士研究生论文张永明效刺激机体适应性免疫反应，对表达M U C l 的肿瘤细胞产生肿瘤生长抑制作用。联合应用C p GO D N 与P o l y ( I ：C ) 辅助肿瘤相关抗原M U C l 是否能有效刺激机体抗肿瘤免疫反应，是本文主要想解决的问题。实验中采用测定佐剂刺激后相关细胞因子水平变化及C T L 细胞毒活性的方法，评价抗肿瘤免疫应答的增效作用。并且在联合应用C p GO D N 与P o l y ( I ：C ) 辅助肿瘤相关
5、抗原M U C l 免疫小鼠基础之上，制备了抗M U C 1 的单克隆抗体，为以后研究M U C l 单克隆抗体的生物学功能及应用抗M U C 1 单克隆抗体进行肿瘤治疗做基础。M U C l 粘蛋白，是一种I 型跨膜糖蛋白，主要表达于多种正常组织、器官上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。M U C l 也表达于造血系统的多种细胞表面。在多种肿瘤中存在M U C l的异常表达，主要表现为：表达量增高，可达正常时的1 0 0 倍以上；细胞表面分布的改变，极性分布丧失，整个细胞表面均表达；结构改变，主要由于糖基化不全，出现新的糖链及肽表位。由于M U C l 在肿瘤组织中的异常表达，使其
6、成为一种潜在的肿瘤生物学标志物，目前已用于肿瘤的诊断和生物学治疗。制备M U C 1 单克隆抗体就成为围绕M U C 1 进行肿瘤治疗的基础。由于本研究与临床抗肿瘤的实际应用结合较为紧密，因此有较好的应用前景。4北京协和医学院硕士研究生论文张永明第一部分聚乙二醇修饰的柔红霉素脂质体治疗小鼠白血病模型的研究摘要目的探讨聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，P E G ) 修饰的柔红霉素( D a u n o m b i c i n ,D N R ) 脂质体( P L D N R ) 治疗小鼠白血病模型的疗效及毒副作用。方法采用薄层水化法和主动载药法制
7、备P L D N R ，测定脂质体药物的理化指标，进行体 F L l 2 1 0 细胞增殖抑制实验，体内实验主要包括L 1 2 1 0 实体瘤模型、P 3 8 8肿瘤腹水模型、L 6 15 肿瘤血液系统模型治疗实验和药物对小鼠心肌毒性实验，心肌毒性实验采用原位末端标记法( T U N E L ) 标记凋亡心肌细胞的方法。结果应用激光粒径散射仪测量P L D N R 粒径大小在( 11 0 - 士1 0 ) n m ，柔红霉素药物包封率在9 4 2 1 。L 1 2 1 0 实体瘤模型治疗实验中P L D N R 组抑瘤率为7 7 5 9 ，D N R 组为5 7 5 6 ，两组间有统计学差异(
8、 尸 2 0 0 k D ) 糖蛋白，目前共发现1 7 种【l2 1 。其分子由肽核心和糖链组成，其中糖链约占其重量的5 0 , - - - 9 0 ，多以O 型糖苷键与肽核心相连【I3 1 。M U C l 粘蛋白( 简称M U C l ) ，是一种I 型跨膜蛋白，正常情况下主要表达北京协和医学院硕士研究生论文张永明于多种组织、器官上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布【1 4 1 。最近发现，M U C l 在造血系统的多种细胞( 如T 细胞、B 细胞、树突状细胞等) 中也有表达。在多种肿瘤中，M U C l 异常表达，主要表现为：表达量增高，可达正常时的1 0 0 倍以上；细胞表面
9、分布的改变，极性分布丧失，整个细胞表面均表达；结构改变，主要由于糖基化不全，出现新的糖链及肽表位。由于M U C l 在肿瘤组织中的异常表达，使其成为一种潜在的肿瘤生物学标志物，目前已用于肿瘤的诊断和生物学治疗【1 5 1 。目前，有多种基于M U C l 的免疫原作为疫苗用于肿瘤治疗的研究，有些已经进入临床实验阶段【1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 1 。这些抗体中的大多数的识别表位位于M U C1 V N T R s 中的A P D T R P A P G 区域，如B C 2 识别A P D T R ，H M F G l识别P D T R 等。如上所述，M U C l
10、 在癌变时可发生量和质的改变，出现新的抗原表位，同时，由于M U C I 是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，肿瘤M U C l 可以非M H C 限制性和M H C 限制性方式活化C T L s ，这些活化的C T L s 可杀伤表达M U C l 的肿瘤细胞【2 1 2 2 2 3 1 。因此，M U C l 是肿瘤主动特异性免疫治疗( A c t i v es p e c i f i ci I 衄u n o t h e r a p y ) 理想的靶分子。然而，目前众多研究报道利用合成的肿瘤相关抗原多肽片断作为抗肿瘤疫苗，取得一定的肿瘤治疗效果。但由于肿瘤相关抗原在结构上类似于机体
11、自身来源的抗原，免疫原性一般较弱，不能有效激活机体的抗肿瘤免疫反应【2 4 1 。佐剂( A d j u v a n t s ) 的引入可有效调节机体的免疫反应，增强对肿瘤相关抗原的反应性。因此，近年来免疫佐剂的研究进展非常迅速。佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，例如氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾、脂质体和C p GO D N 新型佐剂等【2 5 , 2 6 , 2 7 l 。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂是目前动物试验中最常用佐剂。有关佐剂的作用机制尚不十分清楚，可能的机制是通过改变抗原的
12、物理形状，延长抗原在机体内保留时间；引起炎症反应，刺激并增强单核吞噬细胞对抗原的处理和递呈能力；刺激淋巴细胞增殖分化，增加扩大免疫应答能力；作为运送工具，将抗原带到有效免疫部位，提高免疫效果。佐剂的应用确实有效，但不能避免的问题是但它们或多或少存在一些缺点，如油佐剂存在粘滞性、稳定性及注射局部反应等问题，A L ( O H ) 3 不足以诱导弱抗原的免疫反应且主要激活T h 2 型免疫细胞，诱导体液免疫应答，不能明显地诱导细胞介导北京协和医学院硕士研究生论文张永明免疫应答，只适用于以抗体为主要保护性免疫疾病的疫苗，如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。二氧化硅微粒佐剂造成色素沉着及脏器粘连等副作用。另
13、外一些佐剂由于制作烦琐，价格昂贵，效果不稳定，限制了它们的推广使用【2 舯。目前F D A批准的唯一可用于人类疫苗的佐剂只有铝盐佐剂。理想的佐剂应以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应，因此发现新的、安全性高、使用更方便的新型佐剂在疫苗研发领域中有着非常重要的意义。考虑到佐剂应用的副作用和目前机制不十分清楚两个方面，我们制定了自己的研究计划，期望寻找到确实有效同时副作用小的佐剂，并揭示其产生效果的分子生物学机制。近年来生物型免疫刺激剂逐渐成为免疫佐剂研究的热点。具有免疫刺激活性的含有未甲基化C p G 基序的寡脱氧核苷酸( C p GO D N ) 能刺激机体的免疫系统，激活多
14、种免疫细胞，产生多种细胞因子，有诱导激活先天免疫应答和适应性免疫应答的能力，目前被用作疫苗佐剂和免疫治疗剂 2 9 , 3 0 】。有研究表X 蝈C p GO D N 和弗氏完全佐剂及其他佐剂相比能更有效激活机体T h l 型免疫应答，增加细胞毒T淋巴细胞( C T L ) 的活性。P o l y ( I ：C ) 是一种人工合成的双链R N A 的类似物，作为免疫调节剂，能够激活先天免疫应答，并能刺激适应性免疫应答向细胞免疫方向发展1 3 。本研究目的是设计一段M U C l 多肽作为肿瘤免疫抗原，联合应用C p GO D N与p o l y ( I ：C ) 作为M U C l 多肽的疫苗
15、佐剂，评价在治疗接种表达M U C I , I 中瘤细胞的小鼠模型中，二者联合应用组的抗肿瘤效果是否优于单用组，寻找更适合的抗肿瘤疫苗佐剂，以期达到更好的免疫治疗效果。另一方面，通过体内外实验检测多种细胞因子的表达情况，探讨这种免疫增效的可能机制。最后，制备了抗M U C 1的单克隆抗体，为以后研究M U C 1 单克隆抗体的生物学功能及应用抗M U C 1 单克隆抗体进行肿瘤治疗做基础。抗肿瘤疫苗的研究至今还处在起始阶段。大部分肿瘤疫苗不能在病人中引起强烈的C T L 应答，因而不能产生相应的治疗性抗肿瘤作用。联合应用C p GO D N ，与- p o l y ( I ：C ) 增强疫苗的
16、抗肿瘤应答给肿瘤疫苗研究带来了希望。北京协和医学院硕士研究生论文张永明材料与方法一、材料与仪器( 一) 试剂M U C l 多肽合成序列：H - ( P r o A s p - T h r - A r g P r o A l a - P r o - G l y - S e r - T h r - A l a - H i s G l y V a l T h rS e r - A l a ) 2 - - L y s - O H ，分子式：C 1 6 6 H 2 6 5 N 5 2 0 5 6 ，分子量：3 8 8 5 2 8( 深圳晶美生物工程有限公司)M U C l 偶联K L H( 深圳晶美生物工程有限公司)C p GO D N ( 2 3 9 5 ) 的合成( 5 - T C GT C G1 盯T C GG C GC G C G C CG 3 ，全程硫代修饰)( 北京赛百盛基因技术有限公司)聚肌胞( p o l y I ：C )( 美国S i g m a 公司)小鼠细胞因子( T N F
