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1、1人源肝癌单链抗体（scFv）基因真核表 达载体的构建和表达【摘要】 目的: 构建人源肝癌单链抗体（scFv）基因真核表达载体 pSectag2/scFv 并在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中获得表达。方法: 利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性 scFv, 用 PCR 技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体 pSectag2, 构建重组载体 pSectag2/scFv, 测序鉴定后, 电转染 CHO 细胞, 利用SDS PAGE 和 Western blot 检测目的蛋白的表达情况。结果: 将 750 bp 人源肝癌 scFv 插入真核表达载体 pSectag2, 经 DNA 测序鉴
2、定正确, 成功构建了pSectag2/scFv。将 Sectag2/scFv 转染 CHO 细胞后获得目的蛋白表达。SDS PAGE和 Western blot 检测表明目的蛋白 Mr 约为 34 000。结论: 成功地构建抗 scFv 真核表达载体 pSectag2/scFv, 并在 CHO 细胞中获得表达, 为人源肝癌 scFv 的进一步的应用研究提供依据。 【关键词】 肝癌 单链抗体 CHO 细胞 基因表达由于种种原因单克隆抗体(mAb)在进入临床中受到了很大的限制1。原因之一是因为动物源性抗体在人体应用时容易诱发 HAMA, 产生不良反应2。近年来, 逐渐发展的抗体库技术为制备高亲和性
3、的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体, 可有效避 HAMA3。噬菌体抗体将表型与其基因型之间精确联结, 单链抗体（scFv）可以在预先并不知道细胞表面受体特征的情况下与肿瘤细胞特异性结合而获得, scFv 蛋白具有分子小、 穿透力强等优点4。本实验室曾利用噬菌体抗体库技术, 构建了全人源肝癌 scFv 噬菌体库, 并筛选到了 1 株肝癌特异性 scFv5, 实现 scFv 的功能性表达, 进一步鉴定 scFv 蛋白的功2能。我们利用筛选到的基因进行蛋白的真核表达。1 材料和方法1.1 材料人源肝癌 scFv 由第四军医大学西京医院肝胆外科实验室提取获得并保存; 质粒 p
4、Sectag2/Hygro B、 E.coli 感受态菌株 DH5 和 CHO 细胞株由第四军医大学生化教研室馈赠; 连接酶及限制性核酸内切酶 Hind 、Not均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒为美国 Promega 公司产品; 质粒 DNA 提取试剂盒购自博大泰克公司; HiTrapNi NTA 鳌合层析介质为美国 Invitrogen 公司产品; 6His mAb、HRP 羊抗鼠 IgG 购自大连宝生物公司; DMEM 培养基、标准胎牛血清为美国 Gibco 公司产品; Eppendorf 电转染电融合仪 4308 为德国 Eppendorf 公司产品。1.2 方法1.2.1 真
5、核表达载体的构建设计扩增 scFv 基因的引物, 上游引物5 CGAAGCTTTCCTCTGAGCTGACTCAGGACCCCTC 3, 含有 Hind 酶切位点, 下游引物 5 ATATAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGT 3, 含有Not 酶切位点, 引物由北京奥科公司合成。用设计的引物 PCR 扩增全长目的基因: PCR 反应条件设定为: 起始 94 5 min 变性; 然后 94 30 s, 65 30 s, 72 30 s, 30 循环; 最后 72延伸 10 min。PCR 扩增产物经琼脂糖电泳后, 凝胶纯化试剂盒纯化回收(具体参见 Promega 小提试剂盒说明
6、书)。将回收的 PCR 产物与载体 pSectag2 用 Hind 、 Not 酶行双酶切, 酶切产物琼脂糖电泳后试剂盒回收, 回收产物经 T4 连接酶 16连接过夜, 将目的基因克隆入载体 pSectag2 中。将构3建的载体转化感受态大肠杆菌 DH5, 以 AMP 筛选出阳性克隆,经 PCR 和 Hind 、 Not 酶切分析鉴定后送北京奥科生物公司进行序列测定, 测序正确的重组载体命名为 pSectag2/scFv。1.2.2 pSectag2/scFv 扩增提取将重组载体 pSectag2/scFv 菌液扩增, 37、 200 r/min 振荡培养 12 h 获得成熟菌液 50 mL,
7、 根据博大泰克中提试剂盒提取重组载体,参见博大泰克中提试剂盒说明书进行。1.2.3 pSectag2/scFv 电转染 CHO 细胞提取的重组载体 pSectag2/scFv 经分光光度计检测定量后, 利用电转染仪转染CHO 细胞。将处于对数生长期的 CHO 细胞用胰蛋白酶消化后取 4106 细胞、电压 600 V、穿孔时间 400 s, 具体操作步骤参见 Eppendorf 电转染点融和仪 4308说明书, 转染后以 10 倍培养液稀释细胞, 转至培养皿内, 培养 24 h 换新培养液, 收集培养上清, 70保存备用。1.2.4 目的蛋白的纯化和鉴定收集 72 h 转染后 CHO 细胞的培养
8、上清, 上清过 0.45 m 滤膜, 用 Ni2+ NTA鳌合层析介质室温结合 1 h, 用洗涤缓冲液洗涤 5 次后, 用含 200 mmol/L 的咪唑洗脱液洗脱获得纯化蛋白。蛋白样品经行 SDS PAGE 分离后电转移至硝酸纤维素膜, 以 5 g/L 脱脂奶粉室温封闭 1 h, 依次加入鼠抗 6His mAb（11 000 稀释, 4过夜）、 HRP 标记的山羊抗鼠 IgG（15 000 稀释, 室温 1 h）, 用化学发光试剂盒于4暗室条件下 X 光片感光显影。2 结果2.1 载体 pSectag2/scFv 的构建分别用 5端和 3引物成功扩增出 scFv 的目的基因（图 1）, 分别
9、对 pSectag2、 scFv 基因行 Hind 、 Not双酶切, 琼脂糖电泳回收, 回收基因连接成目的载体 pSectag2/scFv, 质粒转化感受态大肠杆菌 DH5 获得阳性克隆, 经 PCR 和Hind 、Not 双酶切鉴定（图 1）筛出部分克隆。将筛选的单克隆送北京奥克公司测序鉴定（测序结果 97 858 为目的序列）, 成功构建包含了 scFv 基因的重组载体 pSectag2/scFv。2.2 重组载体转染 CHO 细胞获得目的蛋白表达50 mL 菌液用博大泰克中提试剂盒提取重组载体, 分光光度计检测后, 重组载体电转染 CHO 细胞, 每 24 h 换培养液 1 次。收集
10、72 h 细胞培养上清过Ni2+ NTA 柱获得 1 mg 纯化蛋白。纯化上清蛋白行 SDS PAGE（图 2）和Western blot（图 3）显示上清内含有融合 6His Mr 约 34 000 的蛋白。3 讨论肝癌特异性抗体具有特异识别肝癌细胞, 可以携带抗肿瘤药物及放射显影药物起到治疗及诊断作用。以往杂交瘤技术制备的 mAb 多为鼠源性, 能造成严重的过敏反应, 而且在人体内重复应用时可产生人抗鼠抗体（HAMA）反应6。鼠源性mAb 在人体内常不能有效激活补体和 Fc 受体相关的效应系统, 并对清除抗体的器官产生损害, 因此其应用受到较大限制。噬菌体抗体库技术不需要进行细胞融5合建立
11、杂交瘤, 较好地解决了人体杂交瘤系统低效的问题。该技术无需免疫即可制备全人源抗体, 可有效避免鼠源性抗体在人体应用时诱发 HAMA 反应。同时生物工程系统的发展使蛋白表达技术日臻成熟, 利于抗体蛋白的大规模制备。scFv属小分子抗体, 具有完全抗原结合位点的最小抗体片段, 在肿瘤的诊断及治疗中逐渐显示出其优势7。其可以与毒素、 前体药物转化酶、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子, 也是构建双特异抗体的理想元件。目前国外的一些抗肿瘤 scFv 已进入体内试验阶段。我实验室利用噬菌体抗体库技术, 从 200 多位肝癌患者外周血提取总 RNA 反转录出 cDNA, 构建了人源肝癌 scFv
12、库, 库容量达到 81011, 经过多次筛选, 得到了一株肝癌特异性 scFv, 初步经过噬菌体抗体 ELISA 检测, 结果显示与SMMC 7721 有较强的特异性结合能力5。DNA 测序结果显示: 将重链、 轻链可变区基因序列分别与 KABAT 数据库比较。结果重链可变区基因与人 IgH 链的同源最高达 98% , 轻链可变区基因与人V 链的同源性最高达 96%。我们所用抗体基因由本实验室自行获得, 是目前国内外报道库容量最大的抗体库之一, 这样就保证了能够筛选出特异性更高、 结合能力更强的肝癌 scFv。有希望成为对肝癌诊断及治疗的新抗体。由于原核细胞内缺乏真核生物蛋白质的加工与修饰系统
13、8, 不能表达出蛋白的完整真实特性。为了实现 scFv 的功能性表达, 进一步鉴定 scFv 的功能, 本实验中进行了 scFv 基因的真核表达载体的构建和表达, 在 CHO 细胞中获得了蛋白表达。【参考文献】1Krauss J, Arndt MA, Martin AC, et al. Specificity grafting of human antibody frameworks selected from a phage display library: generation of a highly stable humanized anti CD22 single chain Fv f
14、ragmentJ. Protein Eng, 2003, 16(10): 753-6759.2Azzazy HM, Highsmith WEJr. Phage display technology:clinical applications and recent innovationsJ. Clin Biochem, 2002, 35(6): 425-445.3Sachdev S, Sidhu H, Bing L, et al. Phage displayed antibody libraries synthetic heavy chain comlementarity determining
15、 regionsJ. J Molecu Biol, 2004, 2(23): 299-310.4Souriau C, Rothacker J, Hoogenboom HR, et al. Human antibody fragments specific for the epecific for the epidermal growth factor receptor selected grom large non immunised phage display librariesJ. Growth Factors, 2004, 22(3): 185-194.5薛国柱, 窦科峰, 赵爱志, 等
16、. 全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定J. 肿瘤防治杂志, 2005, 12(6): 401-404.6Hasholzner U, Stieber P, Meier W, et al. Value of HAMA determination in clinical practice an overviewJ. Anticancer Res, 1997, 17(4B): 3055-3058.7Cai M, Zhang H, Hu Y. Single chain Fv antibody against aagiopoietin 2 inhibits VEGF induced endothelial cell proliferation and migration in vitJ. Biochem Biophy Res Commun, 2003, 309(4): 946-951.8Midde
