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1、1建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察 佛波酯作用下的超微结构变化【摘要】 目的： 建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型，并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化. 方法： 无菌条件下取出生2 d 大鼠的椭圆囊上皮，体外培养 17 d；从第 2 日开始用倒置显微镜观察、照相，试验组加入 PMA 30 min，2 h 和 6 h，固定, 透射电镜观察. 结果： 体外培养椭圆囊 1 wk， 12 h 时可见成纤维细胞沿移植物边缘游出，2 d 后内皮细胞聚集，呈铺路石样，透射电镜观察细胞无肿胀，胞膜、胞核完整，线粒体嵴无肿胀，纤毛无脱落；PMA 各试验组细胞形态正常，核糖体
2、密集，高尔基体较前发达，内质网轻度扩张. 结论： 大鼠前庭器官体外培养方法可行，为今后进一步研究提供了实验模型. 【关键词】 毛细胞；前庭；器官培养技术；佛波醇酯类在现代医学和生物学研究中已广泛应用了组织培养技术，它具有在体内研究中无法比拟的优点. 体外培养模型的建立克服了在体内研究中无法解决的难题，应用体外培养技术可拓宽内耳研究的范围，为研究耳聋细胞学的机制和治疗提供一个模型系统，并使体外条件下内耳的病理、生理及药理学研究能得以深入进行1-3. 我们在建立体外前庭器官培养模型的基础上，采用透射电镜技术观察在蛋白激酶 C（protein kinase C, PKC）活化剂佛波酯(phorbol
3、 myristate acetate, PMA)诱导后的前庭上皮细胞超微结构的改变.1 材料和方法1.1 材料2新生 2 d 的 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，体质量(7.31.3)g， （第四军医大学实验动物中心）；Dulbecco 改良细胞培养基（dulbecco s modified eagle s medium, DMEM），HEPES，PMA（美国 Sigma 公司）；Hank 液按配方配制4；SZ 40 型解剖显微镜，IX7 型倒置显微镜（Olympus 公司）；37培养箱（美国 SHELLAB 公司）；显微手术器械 1 套、超净工作台等；ULTRACUT UC6 型超薄切片机（
4、德国 Leica公司）. DMEM 的配制： 25 mmol/L HEPES，100 mL/L 灭活的胎牛血清，1105 U/L 青霉素. 自制鼠尾胶原：取大鼠鼠尾一根，750 mL/L 乙醇浸泡 30 min，在无菌条件下抽取肌腱，置于平皿中，取 1.5 g 剪碎肌腱浸予已灭菌的 20 mmol/L 醋酸溶液 150 mL 中，4 冰箱放置并断续摇动，48 h 后移入无菌离心管，4000 r/min 离心 30 min，吸取上清液，10 磅 10 min 高压灭菌后分装小瓶，-20 冰箱保存. 培养前 1 d 包被培养板. Hank 液配制按文献4的方法逐步加入各成分，高压蒸气灭菌后 pH
5、值调节至 7.27.4.1.2 方法1.2.1 体外前庭器官培养模型的建立按照 Lambert 的方法5，取新生 2 d 大鼠，-20 冰箱冷冻麻醉 5 min 后全身浸入 750 mL/L 乙醇 5 min，无菌条件下断头，置于冰的 Hank 液中，在解剖显微镜下取出椭圆囊，打开囊壁，去除耳石，用吸管悬滴将椭圆囊移入鼠尾胶包被过的24 孔培养板中央，放于 37 ，50 mL/L CO2 培养箱，待组织贴壁后加入适量DMEM 高糖培养液，置于培养箱中培养. 每日于倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日将原液吸出，加入等量培养液. 培养至 1，3，5 和 7 d 取出固定，透射电镜观察.1
6、.2.2 实验分组3将新生 2 d 大鼠 10 只分为实验组及对照组，每组 5 只. 无菌条件下取材后培养过夜，实验组加入含 PMA （1.610-4mmol/L）的培养液，培养 30 min，2 h 和 6 h 后，戊二醛固定.1.2.3 电镜标本制备椭圆囊斑置于 40 mL/L 戊二醛液固定 12 h，然后依次进行锇酸后固定、丙酮梯度脱水、丙酮及环氧树酯浸透包埋步骤，超薄切片机行超薄切片，厚 70 nm. 醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染，JEM 2000EX 透射电镜观察并照相.2 结果2.1 前庭器官体外培养模型的建立培养物在未被污染的培养液中培养 7 d，培养液无混浊，但色泽由橘红渐变黄，倒
7、置显微镜下观察培养物呈半透明状，色泽无发黑，置入培养板中 30 min 贴壁，加液无飘浮，12 h 可见梭形成纤维样细胞生长（图 1A），24 h 可见内皮细胞生长并呈铺路石样增长（图 1B）；实验组培养物与对照组无明显区别.2.2 电镜结果对照组在 15 d 的超微结构无明显差别，毛细胞生长良好，可见表皮板、纤毛，胞膜完整，核膜无消失，核染色质无浓缩、边集，线粒体、高尔基体、内质网均正常（图 2A）. 7 d 毛细胞形态稍不规则，但纤毛胞膜完整，胞内细胞器无明显改变；实验组毛细胞纤毛排列整齐，胞膜、核膜无明显改变，核染色质无浓缩、边集，核糖体密集，高尔基体较前发达，内质网轻度扩张（图 2B，
8、C），各培养时间段细胞间无4明显变化. 3 讨论器官培养是把器官原基、器官的一部分或整个器官放入近似体内环境的培养系统中，保持原有组织间的三维结构和分化程度，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法. 首例成功的听泡培养是 Fell 在 1928 年完成的，为内耳感觉上皮体外培养奠定基础. 在内耳培养中，DMEM 和 MEM 培养基应用较多，DMEM 主要用于神经组织和无血清培养. 本试验采用 DMEM 培养基，组织生长良好. Oesterle 比较悬浮培养法、旋转培养法、凝块培养法培养内耳器官的效果，提示贴壁是保证内耳器官生存的关键. 哺乳动物感受器官在体外存活、生长的难度较大，成年动物组织
9、不易成活，新生鼠内耳周围骨组织出生时柔软且薄，第 2 日稍硬，很容易剥离，第 3 日开始骨化，易破碎，解剖最易.PMA 是一种从东南亚巴豆的种子中发现的佛波醇酯衍生物，在细胞内不易降解，在体内和体外都可以直接激活 PKC，在研究不同种类细胞的生长和分化以及细胞周期的调节上被广泛应用. 应用 PMA 可使血管平滑肌收缩持续数小时，且在 Ca2+浓度恒定时仍能介导血管平滑肌持续收缩6. PMA 对细胞间隙连接通讯具有抑制作用，其主要机制是经 PKC 介导的致连接蛋白过磷酸化，同时发现PMA 可通过影响钙依赖性细胞粘附分子的功能及调控连接蛋白的基因的表达而抑制细胞的间隙连接通讯. 致敏肥大细胞在 P
10、MA 作用下，PKC 的活化可调节酪氨酸蛋白激酶活性，并上调 c fos,c jun mRNA 的表达7. PMA 是 PKC 的强激活剂，有关研究表明： PMA 可以刺激心肌细胞、SE 细胞增殖8-9；PMA 能激活Raf 1 MEK MAPK 信号转导途径，引起 ERK2 表达增加、细胞增殖10-11. 不同浓度 PMA 作用于体外培养的胎鼠脊髓神经元，结果显示加入 PMA 后神经突起不但生长迅速，当 PKC 活性增加时，神经生长突起也相应增加. PKC 活性被抑5制时，神经细胞生长完全受到抑制，甚至死亡12. 我们的实验结果表明，PMA诱导下，体外培养毛细胞 PKC 的表达显著提高13.
11、 本试验实验组电镜结果提示：毛细胞处于蛋白合成激活状态，可能与细胞内一系列 PKC 的表达改变有关. 新生鼠前庭体外培养模型是内耳研究的重要手段，它为研究内耳胚胎发育和分化的调控机制及其探讨多种生长因子对于毛细胞再生修复的作用、治疗感音神经性聋提供理想的实验方法.【参考文献】1Kim TS, Nakagawa T, Lee JE, et al. Induction of cell proliferation and beta catenin expression in rat utricles in vitroJ. Acta Otolaryngol Suppl, 2004,(551): 22-
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13、,15(1 2):31-38.4司徒镇强，吴军正. 细胞培养 M. 西安： 世界图书出版公司，2004：45-46.5Lambert PR. Inner ear hair cell regeneration in a mammal: Identification of a triggering factorJ. Laryngoscope, 1994,104:701-718.6Throckmorton DC, Packer CS, Brophy CM. Protein kinase C activation during Ca2+ independent vascular smooth musc
14、le contractionJ. J Surg Res, 1998,78（1）: 48-53.7陆月明，李莉，黄超. 蛋白激酶对肥大细胞活化信号转导的影响J. 第二军医大学学报， 2001，22(1)：28-31.8 董明清，朱妙章，于军，等. 钠尿肽抑制 SD 乳鼠心肌细胞增殖J. 第四6军医大学学报,2000，21(4)：443-445.9Takahashi T, Ueno H, hibuya M. VEGF activates protein kinase Cdependent, but Ras independent Raf MEK MAP kinase pathway for DNA
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