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1、1分析谷胱甘肽作者：赵利娜，陶佳，赵运胜，廖飞【关键词】 积分法；动力学酶法分析；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽摘要：目的 以谷胱甘肽 S 转硫酶(GST)为模型，探讨有产物抑制时用积分法分析酶反应过程测定底物量的可靠性。方法 从猪肝制备 GST。1 氯 2,4 二硝基苯(CDNB)终浓度为 1.0mmol/L，监测 GST 催化还原型谷胱甘肽(GSH)与 CDNB 结合产物在 340nm 吸收变化。用积分法预测反应终点的产物吸收。结果 优化产物抑制常数可使此积分法所得反应终点产物吸收对剩余底物变化不敏感。此积分法测定 GSH 对常见干扰有抗性。此法测定大鼠肝匀浆中外加 GSH 回收率大于98%，线
2、性响应上限接近 90mol/L，下限接近 2.0mol/L，所得大鼠肝 GSH 含量与文献报道一致。结论 有产物抑制时用积分法也可定量底物；用此积分法进行动力学酶法分析具有一定普遍性，而且有明显优势。关键词：积分法；动力学酶法分析；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽 S 转硫酶；1 氯2,4 二硝基苯Quantification of reduced glutathione by analyzing glutathineStransferasereaction process taking into account of product inhibition)ABSTRACT: Objective To
3、 investigate the reliability of the integrated method for kinetic assay of substrate in the presence of product inhibition using glutathioneStransferase(GST) as model. Methods Purified GST from pig liver was used to catalyze the conjugation of reduced glutathione (GSH) to 1chloro2,4dinitrobenzene (C
4、DNB) (final concentration at 1.0mmol/L), and reaction curve was monitored by product absorbance at 340nm. Maximal product absorbance after the completion of reaction was predicted by the integrated method. Results The optimization of product inhibition constant conferred to resistance to the variati
5、on of residual substrate concentration on the estimation of maximal product absorbance. This 2integrated method for kinetic substrate assay was also resistant to common source of errors. The recovery for extra GSH in rat liver homogenate was above 98% with linear response ranged from 2.0mol/L to 90
6、mol/L. The concentration of GSH in rat liver was consistent to previous reports. Conclusion The integrated method is valid for kinetic assay of substrate when there is product inhibition, and it exhibits some universality as a kinetic method for enzymatic analysis with obvious advantages.KEY WORDS:i
7、ntegrated method; kinetic enzymatic analysis; reduced glutathione; glutathioneStransferase; 1chloro2,4dinitrobenzene还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)有重要生理功能1。用 Ellman 试剂(2, 2 双(4 硝基 2 羧基)二硫化物，DTNB)反应或高效液相层析(HPLC)可测定 GSH23，但巯基化合物对 DTNB 法干扰显著，HPLC 定量 GSH 受到仪器和效率限制。测定谷胱甘肽 S 转硫酶(glutathione Stransferase, GST)催化
8、 GSH 与 1 氯 2,4 二硝基苯(CDNB)结合产物的吸收也可定量 GSH，此法简单易行，不受巯基化合物干扰4。但至今用 GST 测定 GSH 都用终点平衡法，其效率比动力学酶法分析低而成本高。本实验室建立的积分法，即用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线分析酶反应过程，可用于动力学酶法分析定量无产物抑制时不可逆酶反应体系的底物，其可测范围宽，抗干扰能力强59。但对存在产物抑制的复杂体系此积分法是否有效还未确定。GST 反应存在明显产物抑制10。本实验用 GST 测定 GSH为模型，考察此积分法用于有产物抑制的反应体系进行动力学酶法分析定量底物的可靠性，以明确此积分法用于酶法分析
9、的通用性。 1 材料与方法1.1 材料 GSH、半胱氨酸、 巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2,2 双(4 硝基 2 羧基)二硫化物 (DTNB)均购自 Sigma 公司，2,4 二硝基氯苯(CDNB)购自 ICN，磷酸纤维素 P11 购自 Whatman，其余试剂为国产分析纯。31.2 方法1.2.1 GST 的制备 操作均在 4下进行。市售新鲜猪肝 150g 用 10.0mmol/L TrisHCl 缓冲液(pH7.8，含 250mmol/L 蔗糖，1.0mmol/L EDTA，0.50mmol/L DTT)按 12 匀浆；离心后上清用 45%-85%硫酸铵分级；沉淀溶解透析后上磷酸纤维素
10、柱，相同缓冲液洗去疏松结合蛋白，含 0.2mol/L NaCl 的缓冲液洗脱活性部分。用0.2mmol/L GSH 和 CDNB 在 25测定酶活性，据 340nm 吸光度变化按9.6mmol/(Lcm)计算产物生成速度11。1.2.2 反应过程监测 反应体系为 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5) 2.0mL，50L CDNB 无水乙醇溶液 (终浓度为 1.0mmol/L)，稀释样品 0.35mL，记录 340nm 初始吸收(A0，相当于本底)，再加入 5L 酶液反应体系 GST 活性高于0.03mmoL/(minL)启动反应，延迟 30s 后以 10s 间隔记录吸光度变化，直到吸光度
11、变化小于 0.001 或最大吸光度达到 1.200。同时记录反应 30min 后的吸光度为终点平衡法的结果。标准 GSH 溶液用 DTNB 法校正。用 50mol/L GSH 测定半胱氨酸、巯基乙醇、DTT 等的干扰。1.2.3 GST 反应曲线分析 GSH 低于 100mol/L 时 GST 反应为乒乓机制1012。在 GSH 低于 100mol/L 而 CDNB 为 1.0mmol/L 时 GST 可近似为单底物反应。按乒乓机制的微分速度方程积分乘以反应时间为自变量的形式10,13，除了产物抑制常数 Kiq 以外均采用文献中提供的参数。以反应体系的最大吸收(Am)为非线性参数，用于拟合启动
12、反应 40s 后 6 个以上吸光度变化大于 0.001 的数据搜索对应最好拟合的 Am 为待测参数。底物浓度太低造成反应 5min 后没有 6 个以上吸光度变化大于 0.001 的数据，则用反应 5min 后吸收加 0.001 为 Am。产物净吸收为4(Am-A0)。反应曲线拟合所需程序用 Visual Basic 6.0 编写，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文本文件。1.2.4 大鼠肝匀浆 GSH 浓度测定 Wistar 大鼠全麻后取肝脏，称重后用 4预冷磷酸盐缓冲液(pH 6.5，含 0.50mmol/L DETAPA)制成 30%匀浆，离心后上清用高氯酸沉淀蛋白质，等
13、体积二氯甲烷去色素后离心，上清用 3mol/L 磷酸钾调节pH 至中性，再离心后取适量(约 30L)上清按前述操作测定反应曲线。1.2.5 蛋白质测定 用双缩脲法测定肝匀浆蛋白质量浓度14。1.2.6 统计学处理 结果用s 表示，SAS8.2 作统计分析，P0.05 为有统计学意义。 2 结果和讨论2.1 积分法预测终点产物吸光度的影响因素 1.0mmol/L CDNB 在 340nm 有较高吸光度，需此 CDNB 本底吸光度(A0)才能确定产物净吸收。反应体系 CDNB 浓度基本不变，但 CDNB 醇溶液加样重复性较低，A0 波动大(0.4950.019,n=6)。独立测定 GST 作用前的
14、 A0 可有效提高确定产物吸收的精度(数据省略)。CDNB 浓度为 1.0mmol/L 时双倒数法得 GST 对 GSH 米氏常数(Km)为(0.210.02)mmol/L(n=4)，GSH 浓度为 1.0mmol/L 时其对 CDNB 的 Km 为(623)mol/L(n=4)，均与文献结果一致1011。故用此积分法预测产物吸收时，除产物抑制常数(Kiq)外均采用文献参数。反应体系初始 GSH 高于 50mol/L 时，反应 2.5min 后剩余底物接近 10.0mol/L，反应 5.0min 后剩余底物仍高于 5.0mol/L。CDNB 与 GSH 加合物对大鼠肝碱性 GST 的 Kiq
15、接近 7.0mol/L10。用此积分法分析初始 GSH 略大于 50mol/L 时启动反应 40s 后(起点底物接近 27mol/L)的反应曲线发现，此积5分法对 Kiq 偏差的敏感性受终点剩余底物的显著影响。终点底物接近 10.0mol/L时，预设 Kiq 为 4.0mol/L 时所得结果与终点平衡法偏差小于 1.5%，预设 Kiq 为7.0%mol/L 或 2.0mol/L 时所得结果偏差接近 3%，不计产物抑制则所得结果降低约 10%；终点底物接近 5.0mol/L 时，预设 Kiq 从 2.0mol/L 上升到 7.0mol/L所得结果与终点平衡法偏差均低于 2.0%，不计产物抑制则所
16、得结果降低不到 3.5%；当剩余底物低于初始底物的 2%时，即使不计产物抑制所得结果与终点平衡法偏差也只有 1%。可见只要剩余底物足够低则此积分法对 Kiq 不敏感；当被分析终点底物较高(接近起点的 30%)时，优化 Kiq 也可使此积分法有效，这与模拟分析无产物抑制的酶反应体系结果一致6。积分法所允许终点底物越高，则分析样品所需时间越短；优化 Kiq 使此动力学有效，则用 GST 活性测定样品所需时间只有终点平衡法的 10%，可显著提高分析效率。因此，对此积分法优化所需要的 Kiq 是必要的。2.2 线性响应曲线和抗干扰能力 将 Kiq 固定为 4mol/L 分析反应 5.0min 内数据，此积分法测定 10、20、60mol/L GSH 的变异系数小于 5%(n=5)。对50mol/L 的 GSH，将酶活性降低 30%后此积分法所得结果仍无显著差异(数据省略)。巯基化合物等干扰物质对此积分法预测最大产物吸收都无干扰 (表 1)。
