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1、1融合基因 GMCSFBZLF1 重组腺病毒表 达载体的构建作者：崔瑛 王云 刘成玉 张东峰 【摘要】 目的 构建粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和 EB 病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录 聚合酶链反应分别获得 GM CSF 和 BZLF1 编码序列的 cDNA，应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的 DNA 序列进行连接，构建融合基因GM CSF BZLF1。将融合基因 GM CSF BZLF1 定向亚克隆至pAdTrack CMV 质粒，在原核细胞 E. coli BJ5183 中完成穿梭质粒与
2、骨架质粒pAdEasy 1 的同源重组，构建融合基因 GM CSF BZLF1 真核表达载体pAd GM CSF BZLF1。将真核表达载体 pAd GM CSF BZLF1 转染 293 细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒 vAd GM CSF BZLF1。RT PCR 鉴定感染重组腺病毒的 293 细胞中 GM CSF BZLF1 基因的表达。结果 GM CSF BZLF1 基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAd GM CSF BZLF1 的 293 细胞中检测到融合基因 GM CSF BZLF1 的转录表达。结论 成功地构建了融合基因 GM CSF B
3、ZLF1 重组腺病毒表达载体，为进一步探讨 GM CSF BZLF1 的功能提供了理论基础和实验依据。 【关键词】 疱疹病毒 4 型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体 ABSTRACT Objective To construct human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM CSF) gene and EBV encoding immediate early genes (BZLF1) fused to GM CSF BZLF1 gene and the fusion gene recomb
4、inant adenovirus expression vector. Methods GM CSF cDNA and BZLF1 cDNA were 2acquired by RT PCR. The fusion gene GM CSF BZLF1 was constructed through a polypeptide linker (Gly4Ser) 3 by using spliced overlap extension (SOE). The fusion gene GM CSF BZLF1 was subcloned into pAdTrack CMV plasmid. The s
5、huttle plasmid and the backbone plasmid pAdEasy 1 were recombinated homologously in E.coli BJ5183 cells, then fusion gene eukaryotic expression vector pAd GM CSF BZLF1 were constructed. pAd GM CSF BZLF1 vector was transfected into 293 cells to obtain recombinant adenovirus vAd GM CSF BZLF1. RT PCR w
6、as used to identify the expression of fusion gene GM CSF BZLF1 in 293 cells infected with vAd GM CSF BZLF1. Results The result of DNA sequencing demonstrated that GM CSF BZLF1 gene inserted in the expected site in the recombinant adenovirus expression vector and the insertion sequence was wholly cor
7、rect. The expression of fusion gene GM CSF BZLF1 could be detected in the 293 cells infected with vAd GM CSF BZLF1. Conclusion The fusion gene GM CSF BZLF1 recombinant adenovirus expression vector has been constructed successfully, which might furnish the rationale and experimental evidence for furt
8、her study on the function of GM CSF BZLF1 gene. KEY WORDS herpesvirus 4, human; granulocyte macrophage colony stimulating factor; genes, immediate early; gene fusion; genetic vectors EB 病毒(EBV)是嗜 B 淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒之一。文献报道，该病毒与多种人类恶性肿瘤如 BURKITT 淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)、霍奇金病、免疫缺陷病人的 B 淋巴细胞瘤及胃癌等发生有关1 4。HOSHIKAWA 等1
9、研究表明， EBV 基因组存在于几乎所有 EBV 阳性癌组织的癌细胞中，提示 EBV 可能是治疗 EBV 阳性肿瘤的理想靶点。EBV 即刻早期基因(BZLF1)是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。EBV 大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤 EBV 阳性肿瘤细胞的作用5。粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)主要由 T 细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将 GM CSF 基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答6。本研究拟将 GM
10、CSF 编码基因和 BZLF1 进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对 EBV 阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗 EBV 相关肿瘤提供实验基础和理论3依据。 1 材料和方法 1.1 主要试剂、质粒和细胞系 限制性核酸内切酶 EcoR和 Bgl，T4 DNA 连接酶，DL 10 000 DNA Marker，DL 2 000 DNA Marker，Taq DNA 聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA 转染试剂盒 Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。DMEM
11、培养液、TRIzol、胎牛血清购自美国 GIBCO 公司。反转录酶为 Promega 公司产品。QIAEX 纯化试剂盒购自QIAGEN 公司。携带 GFP 报告基因的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV，E1 区和E3 区缺失的复制缺陷 5 型腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1，大肠杆菌 BJ5183 和DH10B 以及人胚肾 293 细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV 阳性 B95 8 细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。 1.2 引物设计 根据 GM CSF 和 BZLF1 开放读码框序列，以 DNAStar 软件设计扩增人GM
12、CSF 和 EBV BZLF1 基因的特异性引物，并在 GM CSF 上游引物的 5 端引入 Bgl酶切位点和保护性碱基 GA，下游引物 3 端删除终止密码 TGA，引入linker;BZLF1 下游引物 5 端引入 EcoR酶切位点和保护性碱基 GC，上游引物3 端引入 linker。linker(Gly4Ser)3 为编码 15 个氨基酸组成的疏水性多肽的 DNA 序列，序列为5 GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC 3。GM CSF 引物(上游 P1、下游 P2)和 BZLF1 引物(上游 P3、下游 P4)序列见表 1。上述序列中下
13、划线部分为 linker，黑体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(PAGE 纯化)，扩增产物 GM CSF 长为 470 bp，BZLF1 长4为 785 bp，融合基因长为 1 210 bp。 1.3 GM SCF 和 BZLF1 基因的扩增 取正常人外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。将收集的单个核细胞加入含有植物血凝素的 DMEM 培养液中，37 活化 2448 h 后收集活化的单个核细胞。采用 TRIzol 一步法分别提取外周血活化的淋巴细胞总 RNA 和 EBV阳性 B95 8 细胞系总 RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成 cDNA 用作PC
14、R 反应模板。PCR 反应体系为 25 L，其中包括 10buffer 2.5 L， MgCl21.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各 0.3 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1 U，cDNA 2 L，无菌去离子水补至 25 L。反应条件为：94 预变性 5 min;然后 94 30 s、55 30 s、72 60 s，扩增 35 个循环;最后 72 延伸 10 min。PCR 扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的 8 g/L 琼脂糖凝胶中电泳 30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。切胶回收 PCR 产物，用 QIAEX 纯化试剂盒进行 PCR 产物
15、的纯化。表 1 BZLF1 和 GM CSF 引物设计名称序列长度 GM CSFP1 P1 1.4 目的基因的 TA 克隆和测序 分别将 GM CSF 和 BZLF1 PCR 的纯化产物与 pMD18 T 载体连接，转化入高效 E.coli DH10B 感受态细菌中，在含有 x gal 和 IPTG 的氨卞青霉素 LB 平板上进行蓝白斑选择。分别将 TA GM CSF 和 TA BZLF1 阳性克隆送北京华大基因研究中心进行 DNA 序列测定，测序结果与 GenBank 中 GM CSF 和 EBV 标准株 BZLF1 编码基因序列进行比对。 1.5 融合基因 GM CSF BZLF1 的构建
16、 以 TA GM CSF 和 TA BZLF1 质粒为模板进行 PCR 扩增反应，分别获得带有 linker 互补序列的 GM CSF 和 BZLF1 片段。将 GM CSF 和 BZLF1 的 PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板采用重叠延伸 PCR 法7获得融5合基因片段 GM CSF BZLF1。重叠延伸 PCR 反应体系容积为 50 L, 包括10buffer 5 L， MgCl2 3 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，上下游引物 P1、P4 分别为0.5 mmol/L，高保真 Taq DNA 聚合酶 2.5 U，模板 2 L，无菌去离子水补至 50 L。反应条件为：95 预变性 2 min;然后 95 45 s、58 45 s、72 2 min，扩增35 个循环;最后 72 延伸 10 min。延伸结束以后，向 PCR 体系中加入 dATP 2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1 U，继续 72 延
