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1、1低分子肝素对 COPD 模型大鼠 MMP9 及 TIMP1 影响作者：李斌 佟丽 程兆忠 孙妮娜 【摘要】 目的 观察低分子肝素(LMWH)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型肺组织基质金属蛋白酶 9(MMP 9)及组织金属蛋白酶抑制物 1(TIMP 1)表达的影响,探讨其对 COPD 可能的干预机制。方法 随机将 30 只 Wistar 大鼠分成 3 组, 每组 10 只。对照组大鼠正常饲养 40 d, 不做任何干预; COPD 模型组大鼠用香烟染毒加气管内注入脂多糖法建立 COPD 模型并给予生理盐水皮下注射, 每天 1 次; LMWH 干预组大鼠造模后给予低分子肝素 150 U/kg
2、 皮下注射, 每天 1 次, 治疗40 d。观察 3 组血气、肺组织病理学改变,采用免疫组织化学法检测肺组织MMP 9 和 TIMP 1 表达。结果 LMWH 干预组大鼠肺组织的病理改变程度减轻, MMP 9 表达减少, 其阳性面积及 MMP 9/TIMP 1 与 COPD 模型组比较差异有显著意义(F=6.39、56.04，q=26.72、3.34,P0.01)。结论 LMWH 可能通过调节MMP 9、TIMP 1 表达, 减轻肺气肿时肺泡壁破坏过程中细胞外基质的降解, 发挥治疗 COPD 的作用。 【关键词】 肺疾病,慢性阻塞性;肝素,低分子量;明胶酶 B;组织金属蛋白酶抑制物1 ABST
3、RACT Objective To observe the effects of low molecular heparin (LMH) on expressions of matrix metalloproteina se 9 (MMP 9) and tissue inhibitors of metalloproteinase 1 (TIMP 1) in lung tissue of Wistar rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the possible intervention mechanism of
4、this condition. Methods Thirty Wistar rats were equally randomized to control group: normally raised for 40 days without any interference; COPD model group: cigarette inhalation plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide and hypodermic injection of normal saline, once a day; LMH group: LM
5、H, 150 U/kg, hypodermic injection, once a day for 40 days. Blood gas, histology of lung tissue, and MMP 9/TIMP 1 expressions 2wereexamined. Results Pathological changes of the lung tissue in LMH decreased, compared with COPD model group, the diffe rences of expression of MMP 9 and the ratio of MMP 9
6、/TIMP 1 were significantly different (F=6.39,56.04;q=26.72,3.34;P0.01). Conclusion Low molecular heparin educes its effect on therapy of COPD probably by regulating the expressions of MMP 9 and TIMP 1, lessening the degradation of extracellular matrix in the process of destruction of extracellular m
7、atrix of alveolar wall when emphysema happened. KEY WORDS Pulmonary disease, chronic obstructive; Heparin, low molecular weight; Gelatinase B; Tissue inhibitors of metalloproteinase 1 呼吸道细胞外基质重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)不可逆性气流受限的重要病理基础。基质金属蛋白酶(MMP)在细胞外基质破坏中起重要作用。本研究以COPD 模型大鼠为研究对象,予低分子肝素(LMWH)干预，观察其血气、肺组织病理学改变
8、及肺组织基质金属蛋白酶 9(MMP 9)及组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP 1)表达，探讨 LMWH 在治疗 COPD 方面的作用及其可能的机制。 1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 主要药品和试剂: LMWH(法安明, 辉瑞比利时公司), 脂多糖(LPS，美国 Sigma公司), 兔抗鼠 MMP 9 抗体、兔抗鼠 TIMP 1 抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。主要仪器: 有机玻璃熏箱(北京呼吸病研究所), OLYMPUS CH 显微镜及显微照相仪(日本奥林巴斯公司), VIDAS 21 型图像处理系统(德国欧波同公司)。 1.2 动物分组与处理 选择纯系雄性 Wistar 大鼠 30 只
9、,鼠龄 3 个月,体质量 200240 g,由青岛市药检所动物实验中心提供。将动物随机分为 3 组: 对照组 10 只,正常饲养 40 d,不做任何干预,作为空白对照;COPD 模型组 10 只,第 1、14 天气管内注入 LPS 200 g(200 L),第 213 天、第 1540 天每天上、下午分别将大鼠置于密闭有机玻璃箱内熏将军牌香烟各 0.5 h,每次 10 支香烟,共 20 支,通过箱侧壁孔使箱内气压与大气压相等,中间间隔 4 h,第 140 天给予灭菌生理盐水 1 mL 皮下注射,每天 1 次; 3LMWH 干预组 10 只,造模方法同模型组,给予 LMWH(剂量为 150 U/
10、kg)1 mL皮下注射,每天 1 次,治疗 40 d。 1.3 动脉血气分析 3 组大鼠用 100 g/L 的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,然后固定于手术台上,迅速打开腹腔,自腹主动脉抽取 0.5 mL 动脉血迅速送实验室进行血气分析。 1.4 肺组织光镜制片及染色 3 组大鼠迅速打开胸腔,心脏穿刺放血,解剖暴露出气管, 自肺门处分离肺组织, 取右下肺叶, 置于 40 g/L 的中性甲醛固定液内固定 24 h, 常规梯度乙醇脱水, 浸蜡、包埋、切片, 苏木精 伊红染色, 光镜下观察。保留部分切片应用免疫组织化学方法检测肺组织 MMP 9 及 TIMP 1 的表达。光镜下,两者阳性
11、反应为胞浆着色呈棕褐色。取部分切片以 0.1 mol/L 的 PBS 代替一抗作为阴性对照。每张切片在同一放大倍数下随机选取 5 个视野, 应用多功能彩色图像分析系统对MMP 9、TIMP 1 的表达进行分析, 用相对阳性面积表示表达强度。 1.5 统计学方法 应用 SPSS 11.5 及 PPMS 1.51统计软件对结果进行统计学分析, 组间比较采用方差分析。 2 结 果 2.1 动脉血气测定 COPD 模型组动脉血 PaO2 低于对照组,PaCO2 高于对照组,差异有显著性(F=36.27、43.96,q=11.89、13.11,P0.01);LMWH 干预组动脉血 PaO2 和 PaCO
12、2与对照组比较差异有显著性(q=7.63、4.83,P0.01)，与 COPD 模型组比较差异亦有显著性(q=4.26,P0.05;q=8.28,P0.01)。见表 1。 2.2 肺组织病理学改变 4对照组大鼠支气管肺组织上皮结构完整,支气管纤毛排列整齐,无杯状细胞明显增生,气管周围无炎细胞浸润; 肺泡结构完整,无扩张融合,无炎症表现,肺泡大小均匀一致。COPD 模型组大鼠支气管黏膜纤毛柱状上皮细胞部分脱落,纤毛粘连、倒伏、缺失、变性坏死,杯状细胞增生,黏膜下层及肌层大量炎症细胞浸润,部分支气管平滑肌明显增厚; 管腔内充满大量中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及黏液分泌物; 大部分肺泡扩张融合,肺泡隔明
13、显增厚,肺泡直径增大,其中可见炎性细胞浸润,呈支气管炎、肺气肿的特征性病理学改变。LMWH 干预组大鼠支气管肺组织损伤的程度较 COPD 模型组轻,支气管周围炎症较轻,杯状细胞增生程度降低,肺泡扩张融合较明显,同对照组比较仍有差别。 2.3 MMP 9、TIMP 1 的表达 COPD 模型组 MMP 9、TIMP 1 表达增强,二者相对阳性面积及MMP 9/TIMP 1 比值与对照组比较，差异有显著性(F=6.3956.04，q=11.4741.34，P0.01); LMWH 干预组 MMP 9 表达减少,其阳性面积及 MMP 9/TIMP 1 与 COPD 模型组比较差异具有显著意义(q=2
14、6.72、3.34，P0.01)。与对照组比较，LMWH 干预组 MMP 9、TIMP 1 表达仍增强,但 MMP 9/TIMP 1 与对照组比较差异无显著性。见表 2。表 1 各组大鼠动脉血气测定结果表 2 各组 MMP 9、TIMP 1 表达及 MMP 9/TIMP 1 比值的比较(s)组 别 n 相对阳性面积 MMP 9TIMP 1MMP 9/TIMP1 对照组 3 讨 论 肺气肿是 COPD 主要的病理改变之一,严重时在 COPD 气流受限的发生、发展中占主导地位2。 目前认为蛋白酶和抗蛋白酶失衡是肺气肿形成的主要机制之一。MMPs 在肺气肿时肺泡壁细胞外基质破坏中起了重要作用。MMP
15、 9作为 MMPs 家族中的明胶酶,可以降解细胞外基质和基底膜多种成分。TIMP 15是 MMPs 的内源性天然抑制因子所有亚类中活性最强的，其特异性抑制 MMP 9活性。研究表明，COPD 病人肺泡巨噬细胞释放大量活性增高的 MMP 9，诱导痰和肺泡灌洗液中 MMP 9 含量增高35。MERCER 等6报道,COPD 急性加重期病人痰中 MMP 9 含量及活性增加,TIMP 1 减少,二者比值增高,且与肺功能下降有相关性。孔英君等7研究显示，COPD 病人血清 MMP 9、TIMP 1 浓度及MMP 9/TIMP 1 比值增加，与气流阻塞呈负相关。李红梅等8通过动物实验证实，MMP 9、TI
16、MP 1 在气道上皮、成纤维细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及部分肺泡壁细胞表达均明显增强,支气管肺组织 MMP 9、TIMP 1 mRNA 表达亦显著增强,MMP 9 酶活性亦显著增高,并推测 MMP/TIMP 失衡是气道重塑的重要机制之一。 LMWH 由普通肝素酶解或化学降解而得,具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗肿瘤和抑制肾小球系膜细胞及基质增生等作用。目前,国外多项研究发现肝素的抗炎特性区别于其抗凝特性而独立存在。通过体外模拟 COPD 发病机制中的中性粒细胞释放弹性蛋白酶过程,BROWN 等9证实,LMWH 阻止中性粒细胞的聚集并且抑制其诱导的弹性蛋白酶的表达,从而发挥抗炎等作用。但是,LMWH 是否影响在肺气肿时肺泡壁细胞外基质破坏中起了重要作用的 MMPs 的表达,国内外尚未见研究报道。 本研究通过被动吸烟加气管内注入 LPS 法建立 COPD 大鼠模型,动脉血气与COPD 的病理生理改变相似，其肺部病理改变符合 COPD 的变化,表明模型制备成功10,11。免疫组化
