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1、1一起家庭聚集性诺瓦克样病毒感染的调 查作者：戴迎春，聂军，刘翼，李志峰，李建栋，俞守义 【关键词】 人类杯状病毒 【Abstract】 AIM: To investigate the pathogeny, transmission route, clinical symptom and the pathogenesis of a family cluster nonbacterial diarrhea. METHODS: Stool specimens and suspicious food were detected by RTPCR and blasted with GenBank. R
2、ESULTS: The Norwalklike virus (NLVs) was detected from the stool specimens of the child, father, grandfather and the specimen of crab, and the homologous was 100%. CONCLUSION: The family cluster nonbacterial diarrhea is confirmed as a family cluster of NLVs infection. NLVs are detected in food, whic
3、h is rarely reported in our country. 【Keywords】 human caliciviruses; Norwalklike virus; family cluster nonbacterial diarrhea 【摘要】 目的: 调查一起家庭聚集性非菌性腹泻病原、传播途径、临床表现以及病原学特性. 方法: 感染者腹泻粪便及其可疑食物采用 RTPCR 方法检测，并测序. 结果: 患儿、患儿父亲、患儿外公粪便标本及蟹肉标本均扩增出 NLVs 目的片断，测序分析表明该四份标本同源性为 100. 结论: 证实该起家庭聚集性非菌性腹泻为诺瓦克样病毒感染所致，并在食物
4、中检测到诺瓦克样病毒，初步确定了其传播途径. 【关键词】 人类杯状病毒;诺瓦克样病毒;家庭聚集性非菌性腹泻 0 引言 诺瓦克样病毒(Norwalklike virus, NLVs)是引起成人和儿童非菌性急性胃肠炎的重要病原体，与札幌样病毒 (Sapporolike virus, SLVs)合称人类杯状病毒(Human caliciviruses, HuCVs)1. 1972 年，Kapikian 首先用免疫电镜(IEM)在 1968 年美国Norwalk 地区的一所学校暴发的胃肠炎患者粪便中检出了直径为 2732 nm 的球2状病毒颗粒，定名为诺瓦克病毒(Norwalk virus, NV)
5、2. 本研究我们对在广州市进行 HuCVs 感染情况研究时3发现的一起家庭聚集性感染进行了病原学和流行病学研究，证明为 NLVs 所引起的家庭内病毒性腹泻暴发. 1 对象和方法 1.1 对象 首发腹泻病例: 女童，2.5 a, 于 20031001 晚 10 时发病，主要症状为恶心、呕吐(56 次)，并伴有腹痛、腹泻(2 次)，次日上午去医院就诊. 肌注灭吐灵 10 mg，并口服先锋霉素胶囊，用量为 125 mg/d. 此后每日腹泻 23 次，持续 10 d，水样便. 呕吐每日 12 次，多在早饭时，持续 9 d. 食欲差，同时伴有咳嗽、流涕. 患儿于 20031003 开始发烧，最高达 38
6、，持续 5 d. 伴有唇干，眼窝凹陷等脱水体征. 临床诊断为病毒性腹泻，但轮状病毒检测(兰州生物制品研究所轮状病毒 ELISA检测试剂盒)为阴性. 1.2 流行病学资料患儿家于 20031001 午间聚餐，共有七人参加，食用了凉拌蟹肉(患儿外公市面直接购买，自己未加工)，宫爆鸡丁及炒菠菜(患儿外婆加工)等食物. 除患儿本人外，患儿表弟、患儿父亲和患儿外公先后发病，而患儿母亲、患儿姨妈和患儿外婆均未发病. 前两者均在聚餐当晚 11 时发病，以腹泻和发烧为主要症状，2 d 后好转. 两人均食用了凉拌蟹肉. 患儿外公于 20031002 晚上 8 时发病，以腹泻为主，2 d 后好转. 经仔细询问，仅
7、患儿外公(因海鲜过敏)否认进食凉拌蟹肉，其他六人均食用了凉拌蟹肉；七人均食用了宫爆鸡丁及炒菠菜. 1.3 方法 1.3.1 标本采集 20031002 收集患儿、患儿母亲、患儿父亲、患儿外公及患儿外婆的粪便标本及 20031001 剩余的蟹肉、宫爆鸡丁和炒菠菜进行 RTPCR 检测NLVs. 患儿表弟和姨妈外出，未能收集到其粪便标本. 31.3.210%粪便(剩菜)悬液的制备及病毒 RNA 提取取 1 g 粪便(蟹肉、宫爆鸡丁和炒菠菜)样品加 Hanks 液 10 mL(含庆大霉素 800 u/mL)，并彻底震荡使之悬浮，4下 3000 r/min 离心 20 min，取上清并保存在-70冰箱
8、中备用. 提取病毒核酸用 Trizol(Gibco 方法)从 100 L 粪便悬液中提取、纯化 20 L 病毒 RNA. 1.3.3 毒株阳性对照为 EP20020005 Musgrove，由荷兰国立公共卫生和环境研究院 Erwin Duizer 博士惠赠. 1.3.4 反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测 NLVs 引物 JV13I/JV12Y 序列(Tab 1)，RT 反应：反应体系 25 L，缓冲液组成：5RNA buffer 5 L，BSA 2.5 L， dNTPs (10 mmol/L each) 1 L， JV13I 1 L (25 nmol/L)， RNA inhibitor (
9、40106 U/L) 0.13 L，AMVRT (5106 U/L) 0.7 L，DEPC 水 12.7 L，42孵育 1 h. PCR 反应：PCR 缓冲液组成: 10PCR Buffer 5 L，Taq polymerase (2 U/L) 1.3 L， JV12Y (15 nmol/L) 1 L，dNTPs (10 mmol/L each) 0.5 L，RT 产物 5 L，dH2O 37.2 L，共 50 L4. 94 3 min；94 1 min，37 1.5 min，74 1 min (40 cycles)；74 7 min. NLVs 可得到 327 bp 的扩增产物.表 1 引物
10、 JV13I/JV12Y 检测 NLVs（略） 1.3.5 凝胶电泳 PCR 扩增产物经 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳，分子量标准采用大连宝生物 100 bp DNA Ladder marker. 2 结果 患儿、患儿父亲、患儿外公粪便标本及蟹肉标本均扩增出目的片断，患儿母亲、患儿外婆粪便标本、宫爆鸡丁及炒菠菜均未扩增出目的片断(Fig 1). 将扩增出的PCR 产物用 DNA 快速纯化试剂盒(鼎国公司)纯化后，由上海博亚公司测序. 提交 GenBank 进行 Blast 分析，与 NLVs RNA 依赖性 RNA 聚合酶 AF126951 同源性最高达到 97(260/267)，表明感染的是
11、 NLVs(Fig 2，3). 测序分析同时表明该四份标本同源性达 100，均为 NLVs G，提示为同源病毒感染. 3 讨论 随着分子生物学技术的发展和检测手段的进步，HuCVs 的重要性和危害性正4逐渐被全面得以认识. 美国疾病控制中心(CDC)最新估计，96的非细菌胃肠炎暴发与 NLVs 有关. 在美国每年发病达到 2300 万例，其中约有 5 万例需住院治疗，并造成约 300 例死亡. NLVs 可通过多种途径传播，即人人直接接触传播、食物性传播(生食海产品尤为重要)、水源性传播. 其中人人传播又可分为两条途径：粪口传播和呕吐物的气溶胶传播. 这些特点使 NLVs 非常容易发生家庭内传
12、播，出现家庭聚集性感染5. 国外研究也证明 NLVs 家庭聚集性感染现象较多见，这种家庭聚集性感染可由连续性传播和共同媒介传播造成6. 但国内有关 HuCVs 感染的研究刚刚起步，罕见有关报道. 本研究报告的是我们在对广州地区 HuCVs 感染情况进行调查时所发现的一起家庭聚集性感染，参加聚餐的 7 人中有 4 人发病，其中 3 人的粪标本中检出了基因序列一致的 NLVs，经与 GenBank 的有关病毒序列比对，检出的病毒属 NLVs G. 结果证明此例家庭聚集性感染是由 HuCVs 中的 NLVs G所致，是一次NLVs G所致的家庭内的病毒性腹泻暴发. 国外曾有在食品及水源中检出 NLV
13、s 的研究报道7, 8，如日本在采集各季节的 191 只牡蛎中，17 只检测出 NLVs(约 10%)，其中 11 只 NLVs 拷贝量超过 102拷贝，表明 NLVs 可经食物和水源传播. 我们的研究首次在国内报告在食品(凉拌蟹肉)上检出 NLVs，提示国内食品也存在 NLVs 的污染，可以传播 NLVs. 流行病学调查表明除患儿外公、参加聚餐的 6 人均食用了被 NLVs 污染了的蟹肉，其中患儿、姨家小孩和患儿父亲出现腹泻. 经分子生物学检测证实患者粪标本中的NLVs 与凉拌蟹肉中的 NLVs 具的相同的基因序列. 证明此例家庭聚集性感染是由共同媒介经食物传播所引起的感染. 患儿外公未曾食
14、用凉拌蟹肉，但也在第二日出现了腹泻，并且分子生物学检测5证明与其他三人感染的毒株及凉拌蟹肉的毒株基因序列具有一致性，提示其感染的病毒可能也来源于蟹肉. 调查发现外公虽然未曾食用蟹肉，但凉拌蟹肉是由其购买的，推测外公感染 NLVs 可能与其在购买挑选过程中或其他途径接触到污染源9，如家庭内的密切接触或由呕吐物产生的气溶胶传播有关. 本研究亦发现成人感染 NLVs 后，症状并不严重，但是患儿却症状较重，腹泻持续达 10 d，并造成中度脱水，同时伴有发烧、咳嗽. 整个随访过程中患儿就诊两次，输液两次，医疗费用达 500 多元，影响其上幼儿园 6 d. 疾病造成的直接负担亦比较大. 研究证实了一起由
15、NLVs G所致的家庭聚集性感染，是一起 NLVs G引起的病毒性腹泻暴发，感染由被 NLVs 污染的食物所致. 同时，暴发病例中亦可能存在除食物外的其他传播途径. 研究提示人们要注意海产品的食用方式，食用前应充分加热并防止二次污染，这对于预防 NLVs 的感染极其重要. 【参考文献】 1 Green KY, Chanock RM. Taxonomy of the caliciviruses J. J Infect Dis, 2000; 181 (S2): S322-S330. 2 Kapikian AZ. The discovery of the 27nm Norwalk virus: A
16、historic perspective J. J Infect Dis, 2000; 181(S2): S295-S302. 3 戴迎春, 聂军, 刘翼, 等. 广州地区人类杯状病毒感染的初步研究J. 第一军医大学学报, 2004;24(3)：296-299. Dai YC, Nie J, Liu Y, et al. Fundamental study of human calicivirus infection in Guangzhou J. J First Mil Med Univ, 2004;24(3)：296-299. 4 Vennema H, de Bruin E, Koopmans M. Rational optimization of generic primers used for Norwalklike virus detection by reverse transcriptas
