《塞来昔布联合卡培他滨对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《塞来昔布联合卡培他滨对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1塞来昔布联合卡培他滨对裸鼠人肝癌模 型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响作者：黄新余，王洪成，潘烨，戚大川，艾开兴，郑起【摘要】 目的 研究环氧化酶-2 抑制剂塞来昔布(Celecoxib)和化疗药物卡培他滨(Capecitabine)对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法 建立 LIC-D35 裸鼠人肝癌模型，成瘤后 40 只裸鼠随机分成 4 组即对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组(卡培他滨与塞来昔布)。观察肿瘤大小，计算抑瘤率;采用RT-PCR 方法观察肿瘤中 COX-2 的 mRNA 表达，并应用免疫组化法 Ki-67 检测肿瘤细胞增殖水平、末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNE
2、L)检测凋亡细胞。结果 对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组瘤体体积分别为(3 880438)mm3、(3 374465)mm3、(1 859362)mm3 和(981197)mm3;塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组抑瘤率分别为 15%、45%和 71%。四组中 Ki-67 阳性率分别为46%、32%、25%和 11%;肿瘤细胞凋亡指数 DI 分别为 8%、22%、27%和 38%;塞来昔布组、联合组肿瘤组织中 COX-2 mRNA 表达显著低于对照组和卡培他滨组(P0.01)。结论 塞来昔布可显著抑制裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞 COX-2 mRNA 表达，抑制肿瘤细胞 Ki-67 表达，诱
3、导肿瘤细胞凋亡。与卡培他滨联合应用可提高抗肿瘤效果。 【关键词】 环氧化酶-2 抑制剂;裸鼠;肝肿瘤Abstract Objective To evaluate the effect of celecoxib combined with capecitabine on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma in nude mice.Methods LIC-D35 liver tumors were orthotopically implanted in 40 nude mice and divided randomly
4、into 4 groups:the control group(A)，the celecoxib group(B)，the 2capecitabine group(C)and the celecoxib combined with capecitabine group(D).Results Tumor volume was(3 880438)mm3，(3 374465)mm3，(1 859362)mm3，(981197) mm3 in the control，celecoxib，capecitabine and combined group，respectively.The rate of t
5、umor inhibition was 15% in the celecoxib group，45% in the capecitabine group and 71% in the combined group.Immunohistochemical assays for tumor proliferation(Ki-67)showed the tumor cell proliferation Ki-67 positive rate was 46%,32%,25%，11% respectively and apoptosis index(TUNEL)was 8%，22%，27%，38%，re
6、spectively.The expression of COX-2 mRNA by RT-PCR method in celecoxib group and combined group showed it was highly suppressed compared with the control group and capecitabine group.Conclusion Celecoxib can suppress the expression of COX-2 mRNA of tumors orthotopic implanted in nude mice，it reduce p
7、roliferation and induce apoptosis of tumor cell;By combine with capecitabine，it can improve its anti-tumor activities.Key words COX-2 inhibitor;nude mice;hepatocellular carcinoma研究表明，环氧化酶-2 抑制剂可抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤细胞凋亡1。近来研究发现环氧化酶抑制剂可增强肿瘤放射和化疗敏感性2，3。但也有不同报道。文献中环氧化酶-2 抑制剂在肝癌中的研究报道很少，其抗癌作用机制尚不清楚。本实验采用人肝癌裸鼠模型(L
8、IC-D35)，对塞来昔布联合卡培他滨在人肝癌裸鼠模型中肿瘤抑制作用进行研究，并探讨其作用机制。1 材料与方法1.1 构建人肝癌裸鼠模型 BALB/c 裸小鼠(中科院上海实验动物中心提供)，40只均为雄性，SPF 级，4 6 周龄，体质量约 1820 g。取人肝癌裸鼠转移模型LIC-D35 瘤源(复旦大学肝癌研究所瘤源)按照规范原位接种于裸鼠肝左叶内。成瘤率达 100%。随机分成 4 组：对照组(生理盐水)、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组，每组各 10 只。1.2 相关药物及试剂 塞来昔布购自美国辉瑞公司，卡培他滨为瑞士罗氏公司产品，Ki-67 试剂盒、TUNEL 试剂盒均为 DAKO 公司产
9、品。Tripure 总 RNA 提取3试剂盒、M-MLV 逆转录酶、Taq 酶、RNA 酶抑制剂(均购自美国 Promega 公司);COX-2 引物(上海生物工程公司合成)，上游引物:5- CAGCACTTCACGCATCAGTT-3，下游引物:5-TCTGGTCAATGGAAGCCTGT-3，产物片段长 342 bp。1.3 实验方法 肿瘤种植术后 5 天开始治疗。对照组蒸馏水灌胃，每只 0.3 ml/d，连续 3 周;塞来昔布组用 Celecoxib 灌胃，每只 25 mg/(kgd)，连续 3 周;卡培他滨组用 Capecitabine 1.8 mmol/(kgd)，连续 3 周灌胃、
10、联合组 Celecoxib 和Capecitabine，用药剂量及给药途径与单独用药组相同。实验第 42 天用颈椎脱臼法处死所有模型鼠。用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤体积(V)，V=长径短径 2/2。肿瘤抑制率=(对照组体积-实验组体积)/空白对照组体积100%。将标本一半放置液氮中保存，一半置于中性福尔马林中固定。1.4 免疫组织化学染色 肿瘤组织经 10%甲醛固定后，石蜡包埋，4 m 厚连续切片。用免疫组化法 Ki-67 检测肿瘤细胞增殖水平、Ki-67 阳性为细胞核染为棕黄或棕褐色，每例切片观察 5 个高倍视野，每个视野计 100 个细胞中阳性细胞所占百分比。细胞凋亡检测采用末端脱
11、氧核苷转移酶标记法(TUNEL)，按 TUNEL 试剂盒说明书进行，以细胞核呈棕黄色颗粒状为阳性凋亡细胞，在光镜下(400)随机选取 5 个视野对凋亡细胞进行计数，并以 AI 表示凋亡细胞的多少，即 100 个完整细胞中平均凋亡细胞数的百分数表示。1.5 RT-PCR 检测 COX-2 mRNA 表达。(1)总 RNA 的提取：按 Tripure 试剂说明书进行。琼脂糖变性凝胶电泳检测 RNA 的完整性，紫外分光光度计测定 260 nm/280 nm 的吸收峰值以确定 RNA 的含量和纯度，将 RNA 调整至 1 g/l。(2)cDNA 合成:依次加入 MgCl2(25 mmol/L)2 l、
12、dNTPs(各 10 mmol/L)1 4l，RNAsin(40 U/ml)0.25 l、反转录酶 XL(5 U/m 0.5l 0)、随机引物 0.5 l，37 温浴 1 h，合成 cDNA。(3)PCR 反应:以同一 cDNA 为模板，在 30 l 反应体系内扩增 COX-2。循环条件：95 预变性 5 min 后，95 50 s，55 1 min，72 1 min，循环 35 次。最后 72 延伸 7 min。取 5 l PCR 产物于 1.8%琼脂糖凝胶电泳(80 V，30 min)，内对照 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，凝胶成像仪分析 RT-PCR 产物带的积分吸光度值。1.6
13、统计学处理 运用 SPSS 11.5 统计分析软件进行数据处理，组织标本COX-2 mRNA 相对表达值呈非正态分布，比较用秩和检验，免疫组化结果比较用2 检验。检验标准 =0.05。 2 结果2.1 药物对肿瘤生长的影响 见表 1。治疗结束后，对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组移植瘤体积分别为：(3 880438)mm3、(3 374465)mm3、(1 859362)mm3 和(981197)mm3，塞来昔布和卡培他滨组抑瘤率分别为 15%和 45%，两者联用抑瘤率明显增加，达 71%。与对照组比较，塞来昔布组、卡培他滨组和联合用药组肿瘤生长明显缓慢(P0.05)。联合用药组抑瘤率
14、较塞来昔布和卡培他滨单用抑瘤率明显提高(P0.05)。2.2 肿瘤组织中 Ki-67 及 TUNEL 检测 见表 2，图 1、2。对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组的 Ki-67 阳性表达率分别为 46%、32%、25%和 11%，四组中肿瘤细胞凋亡指数 DI 分别为 8%、22%、27%和 38%;表明塞来昔布、卡培他滨能明显抑制肿瘤细胞增殖;并且均能诱导肿瘤细胞凋亡，二者联合运用后其作用进一步加强，各组差异有统计学意义(P0.05)。表 1 药物对人肝癌裸鼠模型中肿瘤生长的影响表 2 肿瘤组织中 Ki-67 及 TUNEL 检测组别 Ki-67(%) TUNEL(%)52.3 COX-
15、2 mRNA 的表达 采用 RT-PCR 方法观察肿瘤中 COX-2 的 mRNA 表达，结果发现对照组、卡培他滨组、COX-2 mRNA 明显表达，塞来昔布组、联合组表达明显抑制(图 3)。经秩和检验，差异有显著统计学意义(P0.01)。表明塞来昔布能明显裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞 COX-2 mRNA 表达。3 讨论肝癌是临床预后较差的肿瘤之一，易发生肝内、外转移，手术切除率低、术后复发率高。因此，寻找有效的抗肝癌药物，可改善肝癌患者的预后。环氧化酶是体内前列腺素合成过程中的重要限速酶，它有 COX-1 和 COX-2 二种亚型，前者是结构型酶，在大多数组织细胞中持续低浓度表达，参与维持机体
16、正常的生理功能。COX-2 是一种可诱导型酶，其基因定位于染色体 1q 25.225.3，约 8.3 kb，含 10个外显子和 9 个内含子，编码 604 个氨基酸的开放阅读框架。研究表明，COX-2在许多恶性肿瘤中高度表达。由于 COX-2 参与多种肿瘤的发生、发展和转移，因此，选择行 COX-2 抑制剂在肿瘤防治中的作用已逐渐成为人们关注的热点。Wang 等1报道，Celecoxib 通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制人结肠癌模型中肿瘤生长。De Heer 等4报道 Celecoxib 能抑制裸鼠结肠肿瘤肝转移。近来有流行病学资料显示 COX-2 抑制剂对肿瘤发生具有肯定的预防作用，在中、高度结直肠癌风险和低心血管疾病风险人群中使用 Celecoxib 可能是最佳选择5。COX-2 抑制剂除对肿瘤本身有一定抑制作用外，它还可以增加化疗药物抗肿瘤活性。Irie 等2动物实验发现 Celecoxib 可以明显加强 5-FU 抗癌作用。Watkin
