《三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1三氧化二砷对骨髓瘤细胞系 U266 抑制增 殖及诱导凋亡的机制研究【摘要】 本研究探讨三氧化二砷（As2O3）在体外对骨髓瘤细胞系 U266 的生物学效应及其机制。 用 MTT 法观察 As2O3 对 U266 细胞增殖的影响，用流式细胞术、DNA 凝胶电泳法分析 As2O3 对 U266 细胞凋亡的影响，以 RTPCR 法检测 2 mol/L As2O3 不同处理时间对 U266 细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT）mRNA 的表达变化，用 Western blot 法检测 As2O3 不同处理时间对U266 细胞 procaspase3、bcl2 及 hTERT 蛋白水平的表
2、达变化。结果表明： As2O3 能明显抑制 U266 细胞增殖，半数抑制浓度（IC50）为 2 mol/L；As2O3 能诱导 U266 细胞凋亡，呈现剂量和时间依赖性；2 mol/L As2O3 不同时间处理U266 细胞后 procaspase3 蛋白及 hTERT mRNA、蛋白表达呈时间依赖性降低,而 bcl2 蛋白表达未发生变化。结论： As2O3 通过改变线粒体跨膜电位，触发了U266 细胞的线粒体凋亡途径，导致了 caspase3 的活化，最终诱导 U266 细胞凋亡；hTERT 表达下调也是 As2O3 诱导 U266 细胞凋亡的重要作用机制。 【关键词】 骨髓瘤Mechani
3、sms Underlying the Effect of Arsenic Trioxide on Proliferation Inhibition and Apoptosis Induction in Myeloma Cell Line U266Abstract The aim of this study was to explore the mechanisms underlying effect of arsenic trioxide (As2O3) on myeloma cell line U266 in vitro. The viability and apoptosis of U26
4、6 cells were observed by MTT assay, flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis. The expression of hTERT mRNA was assessed by RTPCR analysis. The variation of procaspase3, bcl2 and hTERT protein expression were detected by Western blot. The results indicated that the As2O3 could inhibit the g
5、rowth of U266 cells significantly and the concentration of 50% growth 2inhibition (IC50) was 2 mol/L. After treatment with 2.5 mol/L As2O3 at 24, 48 and 72 hours, a dose and timedependent apoptosis of U266 cells could be observed. After treating U266 cells with 2 mol/L As2O3 at different time points
6、, a timedependent reduction of procaspase3, hTERT mRNA and protein was found without any change of bcl2 expression. It is concluded that the As2O3 can change the mitochondrial transmembrane potential, initiating the mitochondial apoptosis pathway, leading in turn to caspase3 activation, and inducing
7、 the apoptosis of U266 cells. These findings suggest that the reduction of hTERT plays a critical role in the apoptosis of U266 cells induced by As2O3.Key words arsenic trioxid; myeloma; U266 cell; cells apoptosis; caspase3; hTERT多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种以骨髓中单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤，多引
8、起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高粘滞血症、肾功能不全等一系列临床表现。目前，MM仍无法治愈。近几年来国内外研究报道，三氧化二砷（As2O3）在复发和难治性MM 的治疗中取得了可喜的疗效。相关基础研究也发现，As2O3 在体外通过使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 P15、P16 和 P21 重新表达或表达增强，下调癌基因 cmyc 的表达以及影响黏附分子表达等多种机制影响骨髓瘤细胞增殖周期，促进其凋亡并影响其归巢。但是，As2O3 对骨髓瘤细胞的作用机制尚未完全清楚1-6。因此，我们以骨髓瘤细胞株 U266 为体外模型，探讨 As2O3 对骨髓瘤细胞的作用及相关机制。材料和方法材料和
9、试剂As2O3 为黑龙江伊达药业公司产品，用注射用水稀释至 1103mol/L 的储存液，使用时用 RPMI 1640 培养液稀释至工作浓度。MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit 购自美国 Biovision 公司。实验中使用的单克隆抗体及二抗均购自 Santa Cruz Biotechnology 公司。3骨髓瘤细胞株 U266 由上海第二军医大学附属长征医院血液科侯健教授惠赠。U266 细胞培养于含 10胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中，在 37、5 CO2、饱和湿度的孵箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。As2O3 对
10、 U266 细胞生长影响的 MTT 法检测将不同浓度 As2O3 处理 48 小时及一定浓度的 As2O3 处理不同时间后的样本置于酶标仪上检测波长 492 nm 的吸光度，每组设 6 个平行孔，以对照组（0 mol/L）细胞增殖率为 100，按下述公式计算细胞增殖率。细胞增殖率（）（药物组 OD492/对照组 OD492）100%细胞凋亡的 DNA 凝胶电泳检测调整 U266 细胞浓度至 2105/ml ，加入 As2O3 使终浓度为 2 mol/L，作用0、24、48、72 小时后，将 5105 细胞移入无菌的 1.5 ml Eppendorf 管中，4 2000 rmin 离心 5 分钟
11、，弃上清。加入 20 l 溶解缓冲液，用移液管尖混匀细胞沉淀。加 10 l RNA 酶 A(500 U/ml)，轻弹管尖混匀。37孵育 90 分钟。加 10 l 蛋白酶K(20 mg/ml)，轻弹管尖混匀，50孵育过夜。样品于 20 g/L 琼脂糖凝胶，25V，电泳 3 小时后，在凝胶成像系统中成像观察。细胞凋亡的流式细胞术检测收集细胞用含 10胎牛血清的 RPMI 1640 培养液接种于 25 ml 培养瓶，细胞浓度为 2105/ml，加入 As2O3 使终浓度为 2 mol/L 和 5 mol/L，空白对照组只含4培养液，处理 0、24、48、72 小时后，收集处理后细胞，计数，然后按 M
12、itoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit 试剂盒说明书进行操作后,立即送流式细胞仪检测。hTERT mRNA 表达的 RTPCR 检测收集 2 mol/L As2O3 不同时间（0,24,48,72 小时）处理组细胞，提取总 RNA, 按照 Promega 公司反转录试剂盒说明书合成 cDNA。hTERT 基因及内参 actin 基因扩增引物由上海生物工程有限公司合成。hTERT 基因上游引物： 5CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA3，hTERT 基因下游引物： 5GGATGAAGCGGAGTCTGGA3,扩增片段 145 bp。内
13、参 actin 基因上游引物： 5CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3, actin 基因下游引物： 5GTCACGCACGATTTCCCGCT3,扩增片段为 619 bp。PCR 条件：94变性30 秒；60退火 60 秒；72延伸 60 秒；共 30 个循环,产物在 20 g/L 琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统显示及分析结果。procaspase3、bcl2、hTERT 蛋白表达的 Western blot 检测收集 As2O3 处理的 U266 细胞，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。每孔加等量的蛋白样品，进行不连续的 SDSPAGE 电泳，电转移至 NC 膜，用 5脱脂奶粉
14、 PBS 于室温下封闭 1 小时，一抗作用 1 小时,洗膜 30 分钟,二抗作用 1 小时,洗膜 30 分钟，ECL 显色系统（Santa Cruz 产品）显示蛋白条带，曝光在柯达胶片上。 统计学处理采用 SPSS 11.5 统计处理软件进行方差分析，以 P0.05 为差别有统计学意义。5结 果As2O3 对 U266 细胞生长和活力的影响不同浓度的 As2O3 处理 U266 细胞 48 小时后，U266 细胞的增殖率与药物剂量呈负相关，IC50 为 2 mol/L（图 1）。同时，用 2 mol/L As2O3 处理 U266 细胞Figure 1. Effect of different
15、 concentrations of As2O3 on the vitality of the myeloma cell line U266（n=6）.后，U266 细胞的增殖率与药物处理时间也呈负相关（图 2）。Figure 2. Effect of 2 mol/L As2O3 on the vitality of myeloma cell line U266 at different time points（n=6）.As2O3 诱导 U266 细胞凋亡的能力DNA 电泳 U266 细胞经 2 mol/L As2O3 处理 24 小时即出现细胞凋亡特征性条带（ladder），且随着时间的延
16、长细胞凋亡逐渐增加（图 3）。Figure 3. DNA electrophoresis of U266 cells treated with 2 mol/L As2O3 at different time points. M: marker. Lane 1: 0 hour. Lane 2: 24 hours. Lane 3: 48 hours. Lane 4: 72 hours.流式细胞术检测 2 mol/L As2O3 处理后，U266 细胞凋亡率随处理时间的延长而增加。2 mol/L As2O3 处理 0、24、48、72 小时后的凋亡率分别是0.54%、11.06%、26.00%、33.96%。同时，不同浓度 As2O3 处理 48 小时后，U266细胞凋亡率随药物剂量的升高而增加。0、2、5 mol/L As2O3 处理 48 小时的凋亡率分别是 0.30%、24.
