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1、1CD44v6、Ecadhesion 表达与乳腺浸润 性癌预后的关系【摘要】 目的 检测 CD44v6、Ecad 在乳腺浸润性癌中的表达情况，探讨它们与乳腺浸润性癌浸润和转移的关系。方法 采用免疫组化 SP 法检测 103 例乳腺浸润性癌中 CD44v6、Ecad 的表达，结合病理指标和临床指标分析其与预后的关系。结果 CD44v6 蛋白表达在细胞浆和(或)细胞膜上，阳性表达率为 76.7%（79/103）。Ecad 蛋白表达主要见于细胞膜，阳性表达率为 35.0%（36/103）。 CD44v6、Ecad 蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学类型无关（P0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P
2、0.05）。在 56 例有随访记录的患者中，CD44v6、Ecad 蛋白表达与患者年龄无关（P0.05），与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移均有关（P0.05）。两者在同一癌组织中的表达呈负相关（P0.01）。结论 CD44v6、Ecad 蛋白表达与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移有关（P0.05），因此 CD44v6、Ecad 蛋白表达可作为判断乳腺浸润性癌的浸润程度、预测预后的参考指标之一。 【关键词】 乳腺浸润性癌 CD44v6、Ecad 蛋白 预后 转移恶性肿瘤转移的机制非常复杂，Liotta 等1概括肿瘤细胞浸润和转移的三步假说为粘附、降解和移动。上述过程中，癌细胞与血管内皮及皮
3、下基底膜异质粘附是其侵袭、转移的关键。恶性肿瘤的发生、发展还与癌基因(cerb2、cmyc、ras)和抑癌基因（p53、nm23）等的异常表达有关。有研究表明，CD44 的异常表达可早于ras、p53 等基因的异常,所以 CD44 的变异可能与 ras 癌基因激活有关,是形成恶性肿瘤的因素之一2。肿瘤细胞从原发部位脱落是肿瘤转移的第一步，这与细胞粘2附功能降低有关，钙离子依赖性细胞粘附分子 Ecad 在维持细胞粘附过程中起重要作用。研究发现多种肿瘤中存在 Ecad 表达异常3，4。本实验利用免疫组织化学法检测了乳腺浸润性癌中 CD44v6、Ecad 的表达情况，结合临床指标，探讨它们与乳腺浸润
4、性癌的相关性，以期为临床诊断、治疗、判断乳腺癌患者预后提供理论依据。1 资料与方法1.1 临床资料收集兰州大学医学部病理教研室及兰州大学第一附属医院病理科手术切除女性乳腺癌标本 103 例。组织学分型按照世界卫生组织肿瘤分类标准5分类。其中小管癌 72 例，浸润性导管癌 11 例，浸润性小叶癌 7 例，髓样癌 13 例。术前均未曾接受放疗和化疗，56 例有随访记录，年龄 2376 岁，平均 48.2 岁。年龄50 岁 21例，50 岁 35 例， 7 例患者术后有复发或死亡，肿瘤大小3cm 者 44 例，3cm 者 12 例。无腋窝淋巴结转移者 11 例，有腋窝淋巴结转移者 45 例。局部复发
5、 14 例，远处转移 20 例。标本经 10%福尔马林固定，石蜡包埋，制成 4m 薄切片，进行常规 HE、免疫组织化学染色。1.2 试剂鼠抗人 CD44v6、Ecad,SP 免疫组化染色试剂盒，DAB 显色剂购于福州迈新生物技术公司。1.3 方法1.3.1 免疫组织化学染色 采用 SP 法染色，石蜡切片制成 4m 薄片，依次二甲苯3脱腊，梯度乙醇水化，PBS(pH=7.4)冲洗 3 次。3H2O2 甲醛溶液室温孵育10min，微波抗原修复 10min，室温冷却后，10羊血清 37孵育 20min，滴加一抗，4冰箱过夜。复温 1h，PBS 冲洗 3 次。加入链亲和素过氧化酶溶液室温下孵育10mi
6、n，PBS 洗 3 次，0.04DAB0.03% H2O2 室温显微镜下控制显色510min，苏木素复染后，脱水，透明，封片， PBS 代替一抗作阴性对照。1.3.2 结果判定 以低倍镜和高倍镜分别观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞膜和(或)细胞浆棕色颗粒沉着，染色明显高于背景，根据细胞百分率及显色深浅计分：（1）阳性细胞百分率：无细胞显色为 0；25%细胞显色为1；25%50%细胞显色为 2；50%细胞显色为 3。 （2）显色深浅不一或显色不清为 0；浅黄色为 1；棕黄色为 2；深褐色为 3。两项乘积：01 分为（）；23 分为弱阳性（）；45 分为中度阳性（）；5 分为强阳性（
7、）。为便于统计，将弱阳性和中度阳性，强阳性归为阳性（）。CD44v6 以细胞浆（膜）出现棕色颗粒为阳性细胞。Ecad 粘附分子跨膜蛋白定位于细胞膜，计细胞膜棕染为阳性细胞。1.3.3 统计学处理 采用 SPSS10.0 统计软件进行检验。2 结果2.1 103 例乳腺浸润性癌 CD44v6、Ecad 蛋白表达结果CD44v6 蛋白表达在细胞浆和(或)细胞膜上（图略）。其阳性表达率为76.7%（79/103）。CD44v6 蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学类型无关（P0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P0.01）。Ecad 蛋白表达主要见于细胞膜（图略）。其阳性表达率为 35.0%（36/
8、103）。Ecad 蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学4类型无关（P0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P0.05），见表 1。表 1 乳腺浸润性癌 CD44v6、Ecad 蛋白表达水平与病理指标的关系病理因素例数 CD44V6 蛋白表达阳性率(%)2PEcad 蛋白表达阳性率(%)2P 组织类型 髓样癌 134969.210323.1 浸润性小叶癌 72571.46114.3 小管癌 72155779.29.757（v=6）0.135*462636.13.982(v=6)0.263* 浸润性导管癌 113872.75654.5 组织分级 级 38162257.9132565.8 级2332
9、087.017.620(v=4)0.00118521.725.550(v=4)0.000 级 4253788.136614.3 组织浸润 级 2112955.881311.6 级3943587.517.822(v=4)0.001271230.08.671(v=4)0.013 级 4383595.2321176.2*Wilocoxon MannWhitney test 表 2 乳腺浸润性癌 CD44v6、Ecad 蛋白表达水平与临床指标的关系 临床病理指标例数 CD44v6 蛋白表达阳性率(%)2PEcad 蛋白表达阳性率(%)2P 年龄 50 岁 2171466.712942.9 50 岁 3
10、592674.32.677（v=2）0.262211440.00.044(v=1)0.520 肿瘤大小 3cm129325.014.9775(v=2)0.0014866.74.134(v=1)0.062 3cm4473784.1291534.1 腋淋巴结转 移 无 118327.33872.7 有4583768.815.832(v4)0.003301533.35.688(v=1)0.013 局部复发 无 42142866.78.936（v=2）0.012212150.05.534(v=1)0.012 有 1421285.712214.3 远处转移 无 36142261.17.610(v=2)0
11、.01258.312.410(v=1) 有 2021890.010.0 随访结果健在 38132565.8191950.0 带癌 112981.810.330(v=4)0.0358327.34.117*(v=2)0.181* 死亡 71685.76114.3*Wilocoxon MannWhitney test 在 56 例有随访记录的患者中，CD44v6 蛋白表达与患者年龄无关（P0.05），与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移、生存时间均有关系（P0.05）。Ecad 蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、生存时间无关（P0.05），与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移有关（P0.05）
12、，见表2。2.2 103 例乳腺浸润性癌 CD44v6、Ecad 蛋白表达的相互关系103 例浸润性乳腺癌中，CD44v6 与 Ecad 表达均阳性者 27 例，均阴性者 15 例。652 例 CD44v6 蛋白表达阳性，而 Ecad 表达阴性。9 例 Ecad 表达阳性，CD44v6蛋白表达阴性。两者在同一癌组织中的表达呈负相关（P0.01）。3 讨论CD44 蛋白是分布极为广泛、具有高度异质性的单链跨膜糖蛋白，是在淋巴细胞成熟和归巢过程中起重要作用的细胞表面粘附分子，能与多种配体和透明质酸、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等结合，参与细胞与细胞、细胞与 ECM 之间的特意性粘连。编码 CD44 蛋
13、白的基因位于人第十一号染色体短臂上，由至少 19 个外显子组合而成。在转录过程中，只有 9 个外显子固定表达，合成标准型 CD44 蛋白（CD44s）,广泛存在于许多细胞，CD44s 主要作为透明质酸受体，结合透明质酸后影响肿瘤的生长和转移。其余可一个或多个通过不同组合插入相应的 mRNA 链中，由此指导合成一系列结构相似但分子大小相异、功能有别的 CD44 蛋白即选择性拼接变异体（CD44v），有组织特异性，CD44v 主要表达于转移的肿瘤细胞，CD44v 的高表达构成了肿瘤细胞的侵袭性与易转移性。以往研究结果对于CD44v6 在乳腺浸润性癌中的作用有不同的意见69。本研究结果显示 CD44
14、v6表达与乳腺癌各临床病理指标之间有显著相关，特别是腋淋巴结转移组与无淋巴结转移组差异明显，这说明 CD44v6 表达与乳腺癌浸润、转移的相关性较大，临床中可单独应用 CD44v6 进行检测，CD44v6 阳性表达的乳腺癌预后较差。Ecad 是一类介导细胞间相互粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维持正常细胞间的连接。由于 Ecad 是上皮细胞中的粘附分子，故对上皮细胞的极性和分化十分必要，其阳性表达有抑制肿瘤转移的作用，当 Ecad 表达降低，或其他因素损害 Ecad 的粘附功能时，肿瘤细胞易于脱落并逃离原发灶发生浸润、转移。有研究发现 Ecad 表达降低与癌的分化、侵袭和转移有显著的相关性
15、10，11。7本研究结果显示，Ecad 的阳性表达与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移呈负相关；提示 Ecad 的表达降低，消弱了乳腺癌细胞间的粘附功能，在其他促转移因素作用下，加速乳腺癌的侵袭、转移。本研究结果显示乳腺浸润性癌组织中 Ecad 失表达与 CD44v6 高表达之间存在负相关。表明 Ecad 阴性、CD44v6 阳性的乳腺浸润性癌易于脱离瘤体，在 CD44v6 分子的介导下癌细胞粘附于血管、淋巴管，促使侵袭、转移发生。【参考文献】1 Liotta LA, Rao CN, Barsky SH. Tumor invasion and the extracellular matrixJ. L
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