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1、1淋巴细胞功能相关抗原-3（CD58）在儿 童期急性 B 淋巴细胞白血病近期疗效判 断中的应用作者：赵惠君，蒋黎敏，袁晓军，李莉，汤静燕，沈立松【摘要】 本研究评估 CD58 在急性 B 淋巴细胞白血病（B-ALL）近期疗效判断中的价值。应用四色流式细胞分析技术观察 135 例儿童期 B-ALL 患者 CD58 分子的表达特点；建立用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合检测 B-ALL MRD 的方案；结合 CD58 的表达情况和 MRD 监测结果分析 CD58 在 B-ALL 中的预后价值。结果表明: 135 例 B-ALL 的平均 CD58 MFI 为 113.0863.33
2、，15 例正常骨髓的CD19+CD10+细胞的平均 CD58 MFI 为 14.685.26，两者差异显著（P0.01）；51.9%（70/135）B-ALL 患者的 CD58 分子强表达，可以用 CD58 为指标进行 MRD检测；CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合的有效频率仅次于TdT/CD10/CD34/CD19，为 51.9%；CD58 高表达组的 MRD 阳性率显著低于 CD58低表达组（P0.05）。结论： CD58 可以作为 B-ALL MRD 检测的指标，此结果丰富了 MRD 检测的组合；CD58 的高表达可以作为 B-ALL 预后较好的指标。 【关键词】 急性 B
3、 淋巴细胞性白血病； CD58； 微小残留病； 淋巴细胞功能相关抗原Prognostic Significance of Lymphocyte Function Associated Anti-gen-3 (CD58) in Childhood B Cell-Acute Lymphocytic LeukemiaAbstract This study was aimed to investigate the value of CD58 in evaluation of early therapeutic effect on childhood B-ALL. The expression feat
4、ures of CD58 in 135 cases of childhood B-ALL were analyzed by four-color flow cytometry; MRD 2detection protocol for B-ALL using CD58/CD10/CD34/CD19 combination was established; the correlation between the expression features of CD58 and MRD detection was analyzed for the early therapeutic response
5、in childhood B-ALL. The results showed that the mean value of CD58 MFI in 135 cases of B-ALL was 113.0863.33，which was significantly higher than that in 15 cases of normal bone marrow controls (14.685.26，P0.01). In addition，CD58 was over expressed in 51.9% (70/135) of B-ALL patients，indicating that
6、CD58 could be an effective marker in MRD detection. The CD58/CD10/CD34/CD19 was the second most effective combination next to TdT/CD10/CD34/CD19 in B-ALL MRD detection with flow cytometry. Meanwhile，the positive rate of MRD detection by flow cytometry was significantly lower in CD58 over expression
7、group (P0.05). It is concluded that CD58 may be used as an indicator for detection of MRD in B-ALL patients，which would enriche the combination of MRD detection. The CD58 over expression may be considered as a marker of a favorable prognosis in childhood B-ALL.Key words B-ALL; CD58; minimal residual
8、 disease; lymphocyte function associated antigenCD58 又称淋巴细胞功能相关抗原-3（lymphocyte function-associated antigen-3，LFA-3），分子量为 28 kD，广泛表达于造血细胞和非造血细胞1。它是 T 细胞表面标志 CD2 的配体，两者同属免疫球蛋白超家族成员，细胞外结构域具有很高的同源性2。通过与 CD2 的特异性识别，CD58 介导了 T 细胞和胸腺上皮细胞、抗原呈递细胞以及靶细胞之间的相互作用，因而在淋巴细胞的活化、再循环及效应功能（包括针对于肿瘤细胞的细胞毒性作用等）中起到重要作用3，4。但
9、作为黏附分子，CD58 可能在肿瘤的转移和浸润中起作用。研究表明，在不同的血液系统肿瘤中，CD58 的表达与预后关系有所不同5-8。但以上研究都是以肿瘤细胞CD58 的阳性百分率作为观察指标，并未从 CD58 在肿瘤细胞表面的表达量的角度给予关注。而且 CD58 在儿童急性 B 淋巴细胞白血病（B-ALL）中的预后作用尚无明确报道。本研究应用流式细胞术分析了 CD58 在 B-ALL 中的表达特点，建立了用 CD58检测白血病微小残留（MRD）的方案，并从 CD58 在 B-ALL 细胞表面表达量的角3度初步评价了 CD58 对 B-ALL 在早期疗效及预后判断中的意义。材料和方法病例135
10、例 B-ALL 患儿均为本院的住院患者。所有患者都经过 FAB 分型法及流式细胞术免疫分型法明确诊断。患者都用 PVDL（泼尼松、长春新碱、柔红霉素和左旋门冬酰胺酶）方案进行诱导缓解治疗。在第 1 疗程结束、达到临床缓解后以及在以后的持续治疗过程中共有 75 例患者用多种抗体组合进行了微小残留病的监测。正常对照 15 例。材料和仪器单克隆抗体 CD58-FITC 单克隆抗体购自法国 Immunotech 公司；CD10-PE 单克隆抗体购自丹麦 Dako 公司；CD34-PerCP 和 CD19-APC 单克隆抗体均购自美国 Becton Dickinson 公司。仪器 流式细胞仪为 FACS
11、Calibur 型（美国 Becton Dickinson 公司的产品）。CD58 在 B-ALL 中表达特点的观察单个核细胞分离 将 B-ALL 初发患者的骨髓标本用 Ficoll 液(密度 1.0770.002 g/ml)分离单个核细胞，用 PBSA（含 0.2%牛血清白蛋白及 0.2%叠氮钠的 PBS）洗2 遍，用 PBSA 悬浮。细胞膜表面抗原染色 4调节每管细胞数为 1106，用 CD58-FITC，CD10-PE，CD34-PerCP 和 CD19-APC 单克隆抗体按抗体说明书进行膜表面抗原标记，用 PBS 洗 2 遍，洗去未结合抗体，用多聚甲醛悬浮待用。检测及分析 测定前先用标
12、准荧光微球校准仪器。用 CellQuest 软件（version 3.2）进行收集。所有患者标本都用同一设定条件检测。结果用 CellQuest 软件（version 3.2）进行分析。用 Sigma Plot 软件进行统计作图。微小残留监测首先确定适合用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合进行 MRD 监测的病例。在 CD58/CD10 双参数图上，以白血病细胞分布在不同于正常细胞出现的区域且与正常细胞区域无重叠者确定为 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合适用。然后以适合用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合进行 MRD 监测的患者，其诱导缓解治疗结
13、束后以及持续治疗过程中的骨髓标本经 Ficoll 液分离单个核细胞以后，用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合进行标记。其他抗体组合如TdT/CD10/CD34/CD19，CD38/CD10/CD34/CD19，CD45/CD10/CD34/CD19，CD66c/CD10/CD34/CD19 和 CD22/CD10/CD34/CD19 检测 MRD 的方法见文献9所述。分析时，如果在初发白血病细胞出现的区域内仍有细胞存在，即判定为 MRD 阳性。以这些残存的细胞占骨髓单个核细胞总数的比例作为 MRD 的数值。CD58 对于 B-ALL 早期疗效及预后的意义的初步评估5将进行过 M
14、RD 监测的 B-ALL 患儿分为 CD58 高表达和 CD58 低表达两组。其分组原则为：患儿 CD58 过强表达，以致 B-ALL 细胞在流式 CD58 和 CD10 双参数点图上与骨髓正常 CD19+CD10+的细胞无重叠，明显区分开时，确认为CD58 高表达组；而其余病例的 B-ALL 细胞在流式 CD58 和 CD10 双参数点图上与骨髓正常 CD19+CD10+的细胞有重叠无法明显区分时，确认为 CD58 低表达组。用 2 检验分析这 2 组病例与 MRD 监测结果的关系。结 果CD58 在 B-ALL 中的表达特点B-ALL 患者的白血病细胞 CD58 阳性率平均为 92 18%
15、，中位数为98.82%（2.47%-99.99%），88 7%的患者 CD58 表达率在 80%以上。平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）可以反映细胞膜表面或胞浆内的抗原表达量，因此本实验通过 CD58 的 MFI 对 B-ALL 和正常骨髓中 CD19+CD10+细胞膜表面的 CD58 表达量作比较（图 1）。实验研究表明，135 例 B-ALL 的平均 CD58 MFI为 113.0863.33，15 例正常骨髓的平均 CD58 MFI 为 14.685.26，两者差异显著（P0.01）。用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合检测
16、B-ALL MRD 方法的建立CD58 在 B-ALL 患者骨髓中的表达量显著高于正常骨髓，如果白血病细胞与正常骨髓中 CD19+CD10+细胞的 CD58 MFI 无重叠，即可作为 MRD 检测的有效指标。如图 2 所示，Ai-Aiii 为正常骨髓细胞，在 Ai 中以 R1 选取单个核细胞；在 Aii 中以 R2 选取 CD19+的单个核细胞；正常骨髓的 CD19+单个核细胞在 CD58 和CD10 双参数点图上的分布如 Aiii 所示，R3 为正常 B 细胞所不会出现的区域，以6“空白区”表示。 “空白区”位置的设定是 MRD 检测的关键。 Bi，Bii 和 Biii 3 例初诊时的 B-ALL 患者的白血病细胞分别分布在 R3“空白区”中，并且与正常 B 细胞的分布范围无重叠，因此这 3 例患者可用 CD58/CD10/CD34/CD19 抗体组合进行MRD 检测。Ci 和 Cii 分别对应 Bi 和 Bii，为 2 例患者经治疗达临床缓解时的MRD 监测结果，在“空白区”中与初诊时白血病细胞分布的
