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1、1人参皂苷 Rb1 对阿尔茨海默病模型细胞 大电导钙激活钾通道变化机制的影响作者：杨勤，陈云波，闫福曼，程淑意，王奇【摘要】 【目的】观察阿尔茨海默病（Alzheimer s disease，AD）模型细胞的大电导钙激活钾通道 BKCa 的变化及人参皂苷 Rb1 对 AD 模型细胞上 BKCa 通道的影响。 【方法】实验分为 A25 35 模型组（终浓度为 5、10、20、40mol/L）、人参皂苷 Rb1 预处理组（终浓度为 0.5、1、2、4mol/L）、治疗组（A25 35+人参皂苷Rb1）和空白对照组。采用膜片钳技术观察各组 BKCa 通道的平均开放时间、平均开放概率和电流幅度，选择
2、A25 35 模型组及人参皂苷 Rb1 预处理组的最佳浓度，并观察人参皂苷 Rb1 对 AD 细胞的作用。 【结果】20mol/LA25 35 可显著降低 BKCa 通道的平均开放时间（P0.05），抑制 BKCa 通道开放； 4mol/L 人参皂苷 Rb1 组 BKCa 通道平均开放概率和开放时间较空白对照组均显著升高（P0.05），与模型组比较均显著升高（P0.05 或 P0.01）。 【结论】人参皂苷Rb1 治疗 AD 的机制可能与其能激活 BKCa 通道、对抗 A25 35 的毒性作用并保护神经细胞有关。 【关键词】 人参皂苷 Rb1/药理学；膜片钳；大电导钙激活钾通道；阿尔茨海默病/
3、中药疗法；细胞培养Abstract：ObjectiveTo observe the changes of large conductance calcium activated potassium channels（BKCa）in rats Alzheimer s Disease（AD） model cells induced by amyloid peptide 25 35（A25 35），and to investigate the effect of ginsenoside Rb1（G Rb1） on the BKCa channel activity. MethodsWe set up
4、 amyloid protein peptide 25 35（A25 35）model groups（in the final concentration of 5，10，20，40mol/L），G Rb1 pretreatment groups（in the final concentration of 20.5，1，2，4mol/L），treatment groups（treated by A25 35 and G Rb1），and blank control group for the experiment. The average opening hours，average openi
5、ng probability and electric current amplitude of BKCa channels were assayed with patch clamp recording technique in order to measure the BKCa channel activity in the rat cortical neurons. The optimal concentration of A25 35 for AD cellular model and the optimal concentration of Rb1 for pretreatment
6、were determined according to the cellular morphology and the BKCa channel activity. ResultsA25 35（20mol/L） markedly decreased the average opening hours of the BKCa channels in the rat cortical neurons（P0.05），and inhibited the opening of BKCa channels. The average opening probability and average open
7、ing hours of BKCa channels in 4mol/L Rb1 group were higher than those in the blank control group（P0.05） and the model group（P0.05 or P0.01）. ConclusionThe therapeutic mechanism of G Rb1 is probably related with the activation of BKCa channels，the counteraction of A25 35 toxicity and the protection o
8、f neurons.Key words:GINSENOSIDE RB1/pharmacology；PATCH CLAMP;人参皂苷 Rbl 是人参的主要活性成分之一1。人参皂苷 Rbl 对学习记忆的促进作用已被实验所证实，对其促进神经递质释放、减轻兴奋性毒性、增强第二信使活性、促进突触可塑性、提高受体密度等作用也有广泛的报道2-3，是人参作用于神经系统和促智的主要有效成分之一。钾通道在调节细胞膜的兴奋性中起重要作用，其分子结构基础普遍保守，因此，对通道不适宜的调控会导致病变。阿尔茨海默病（Alzheimer s disease，AD）患者体内 amyloid protein peptide（A
9、）、Tau 蛋白、 amyloid precursor protein（ APP）、presenilin protein 1（PS 1），presenilin protein 2（PS 2）等为代表的多种内源性致病因素可上调或下调钾通道功能，使其出现异常，从而导致AD 患者早期记忆损失、认知功能下降等症状的出现4-5。由神经元细胞膜电位和胞浆内 Ca2+浓度决定通道启闭的一类钾通道称钙激活钾通道（Ca2+ actived K+channels，KCa）。其中大电导钙激活钾通道（BKCa）分布广泛（如血管平滑肌、神经细胞、心肌细胞和气管平滑肌等），电导值大（100300pS）则在调节细胞膜兴奋性
10、中作用更显著。KCa 开放导致钾离子外流使细胞膜复极化或超极化，细胞膜3的兴奋性降低 6。近期的一些实验证实钾通道开放剂（KCOs）对 AD 有某种潜在治疗价值7，但是有关人参皂苷 Rbl 对 AD 模型细胞 BKCa 通道的影响方面的研究尚未见报道。本实验利用膜片钳技术观察人参皂苷 Rbl 对 AD 模型细胞BKCa 通道变化的影响，探讨其治疗 AD 的可能机理。现报道如下。1 材料与方法1.1 主要药品、试剂及其配制人参皂苷 Rb1 购于中国药品生物制品检定所（批号：0703 200721），A25 35 购自首都医科大学宣武医院神经生化室（批号：P99），细菌蛋白酶 XIV（protea
11、se P5417）、羟乙基磺酸钠、4 羟乙基哌嗪乙磺酸4 （2 hydroxyerhyl）piperazine 1 erhanesulfonic acid，HEPES、Hank s Balance Saline Solution （HBSS）、Earles s Balance Saline Solution （EBSS）均购自Sigma 公司，高蔗糖液（g/L）：蔗糖 80、KCl0.186、Na2HPO40.142、CaCl20.015、HEPES 3.574、葡萄糖1.982，pH7.27.4，羟乙基磺酸钠液（g/L）：羟乙基磺酸钠 19.6、KCl0.149、CaCl20.0147、Mg
12、Cl20.813、HEPES3.574、葡萄糖 4.144，pH7.27.4，Earles s 平衡盐溶液（g/L）：CaCl22H2O0.265、MgSO40.0977、KCl0.4、NaCl6.8、Na2HPO40.122、葡萄糖 1.0、酚红 0.011，pH7.357.4，Hank s 平衡盐溶液（g/L）：KCl0.4、K2HPO40.06、NaCl8.0、NaH2PO40.0479、HEPES2.6、酚红0.011，pH7.27.4，电极内液（g/L）：KCl10.213、CaCl20.061、MgCl20.02、HEPES2.383，pH 7.27.4，细胞浴液（g/L）：KCl
13、10.613、CaCl20.061、MgCl20.02、HEPES2.383，pH7.27.4。以上试剂均采用国产优质分析纯，以去离子水配制而成。1.2 仪器设备 MA752 型震动切片机（美国），CK40 倒置显微镜（日本 Olympus公司），电子天平（德国 Sartorius 公司），水浴箱（上海一恒公司），BS210S 型 pH4计量仪（德国 Sartorius 公司），微量移液器（美国吉尔森公司），EPC 9 膜片钳放大器（德国 Heka 公司），MP 285 型三维操作仪、P 97 微电极拉制仪（均为美国Sutter 公司）。1.3 大鼠皮层神经元的分离选用出生 714d 的 SD
14、 大鼠，雌雄不限（由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：2005A008），迅速取出脑组织，置于氧饱和的冰水互溶的高蔗糖液（04，预先通纯氧 20min）中冻存 2min，期间持续通体积分数 100纯氧。取出脑组织放入震动切片机上，将脑组织沿冠状面切成400500m 厚的脑片 34 片，切片过程中切片槽中放入冰水互溶的高蔗糖液，并持续通纯氧。然后将切好的脑片置于 33、通体积分数 95O2+5%CO2 混合气的 EBSS 液（预先通 20min 体积分数 95O2+5%CO2 混合气）中孵育 50min。将脑片用低钙的羟乙基磺酸钠缓冲液清洗 3 次，移入 2mL 含细菌蛋白酶 XIV（pr
15、otease P5417，1.11.4mg/mL）的 HBSS 液中，再将放脑片的 HBSS 液置于 33水浴箱，持续通体积分数 100O215min。用低钙的羟乙基磺酸钠缓冲液冲洗脑片 3 次，用注射器针头将皮层脑片分离并粉碎，然后用尖端经火抛光处理的口径依次为500、300、150m 的 Pasteur 吸管进行吹打，制成细胞悬液，并将其移入 35mm 的培养皿，待细胞贴壁 20min 后孵育液换成记录液即可用于实验。实验中选用贴壁良好 、细胞膜完整 、折光较好的细胞用于膜片钳实验。1.4 微电极的制作与高阻封接的形成将硬质玻璃毛坯（SUTTER 公司）用 P 97拉制仪拉制成微电极，内灌
16、电极内液后，入水电阻为 714m。通过 Zeiss 正置显微镜观察，用微电极操纵仪驱动微电极，电极入水前在电极腔内加正压，当微电极尖端刚与细胞膜接触时放掉正压，稍加负压形成高阻封接。51.5 单通道膜片钳记录采用细胞贴附式记录神经细胞膜上单通道 BKCa 通道电流，经 EPC 9 膜片钳放大器放大，放大器反馈电阻为 50G 以上，实验中钳制电压由-40mV 逐步去极化到+40mV。采用 PulsefitPulse 采集入计算机，采样频率为 50Hz，采样时间为 10s。采用分析软件 TAC 进行数据处理，测量通道开放和关闭时间的分辨率为 0.2ms，以某一记录电压下的电流幅度的 50作为判断通道开放和关闭的转换；采用 TACFIT 软件作统计学分析，记录中通道成单级或多极开放，对时间数据的分析仅选用单级开放。分析指标有：电流幅度、平均开放时间、电导值、开放概率。1.6 实验分组实验分为 A25 35 模型组
