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1、1吸氧预处理诱导的大鼠脑内 Fos 表达作者：张西京，熊利泽，王曦，胡文能 【关键词】 氧疗 【Abstract】 AIM: To investigate whether oncogene cfos is involved in the regulation of the brain ischemic tolerance induced by oxygeninhaling preconditioning. METHODS: SD rats were randomly divided into 2 groups: oxygeninhaling preconditioning group and
2、control group (n=6 each). The rats in oxygeninhaling preconditioning group inhaled Pure oxyen for 24 h, while the control animals inhaled 210 mLL-1 Pure oxgen for 24 h. 24 h after the treatment, all the rats were perfused transcardially and the brains were moved out. The Fos expression in rat brain
3、was detected by using ABC immunohistochemistry method and the difference between the two groups was studied. RESULTS: There was a widespread expression of Foslike reactivity production and the distribution patterns in the two groups were similar. However, the Fos expression increased in oxygeninhali
4、ng preconditioning rats in the following brain areas: solitary tract nucleus, area postrema, lateral parabranchial nucleus, caudal part of spinal nucleus of 5th nerve, ventrol tegmental nucleus, periaqueductal nucleus, supramammillary nucleus, supraoptic nucleus, hippocampus, subiculum, posterolater
5、al cortical amygdaloid nucleus, anterior cortical amygdaloid nucleus, lateral septal nucleus, bed nucleus of stria terminalis, globus pallidus, Calleja island, occipital cortex, retrosplenial cortex, parietal cortex, forelimb and hindlimb area of cortex, and frontal cortex. CONCLUSION: Some nuclei c
6、an be activated by oxygeninhaling preconditioning. Oncogene cfos is involved in the regulation of the brain ischemic tolerance induced by oxygeninhaling preconditioning. 【Keywords】 oxygen therapy; preconditioning; gene, fos; rats; brain 【摘要】 目的： 观察原癌基因 cfos 是否参与了对吸氧预处理诱导脑缺血耐受的产生. 方法： 随机将大鼠分为 2 组：吸氧预
7、处理组和对照组（每组 n=6）. 吸氧组大鼠吸纯氧 24 h，对照组大鼠吸 210 mLL-1 O2 24 h. 24 h 后经心灌流、取脑；用免疫组化法观察 Fos 蛋白在大鼠脑内的表达，比较两组大鼠的表达差异. 结果： Fos 样免疫反应阳性神经元在脑内分布广泛，两组动物脑内的 Fos 阳性细胞的分布模式非常相似. 但吸氧预处理的大鼠脑内许多脑区 Fos 表达明显增多、2增强. 结论： 吸氧预处理可激活脑内的一些核团；原癌基因 cfos 参与了对吸氧预处理诱导脑缺血耐受的调节. 【关键词】 氧疗；预处理；基因， fos；大鼠；脑 0 引言 自 1990 年 Kitagawa 等1报道脑缺血
8、预处理可诱导脑缺血耐受以来，有大量关于如何诱导脑和脊髓缺血耐受的研究，这些方法包括短暂脑缺血2、药物预处理3-8和高压氧预处理9-11等. 对于脑缺血耐受的机制尚无定论. 在我们以往的研究中发现，动物持续吸入纯氧 24 h，间隔 24 h 后可以诱导明显的脑缺血耐受，我们称之为吸氧预处理. 对于吸氧预处理诱导脑缺血耐受产生的机制尚不清楚，因此，本试验我们观察了吸氧预处理后即刻早期基因 cfos 的产物 Fos 蛋白在脑内的表达，以了解原癌基因 cfos 是否参与了对吸氧预处理诱导脑缺血耐受的调节. 1 材料和方法 1.1 材料雄性 SD 大鼠 12 只，体质量 230250 g，第四军医大学实
9、验动物中心提供. 1.2 方法 1.2.1 动物处理及切片制备大鼠在温暖、自然光线、水和食物充足、相对安静并且可自由活动的环境中存活 1 wk. 随机分为 2 组：吸氧预处理组和对照组各 6 只. 吸氧预处理组大鼠吸入纯氧持续 24 h 后经心脏灌注；对照组大鼠不给予吸氧预处理，余同吸氧预处理组. 10 gL-1 戊巴比妥钠（80 mgkg-1）腹腔内注射，麻醉后开胸，经心脏灌注，先用 9 gL-1 生理盐水 100 mL 冲净血液，然后用预冷的 40 gL-1 多聚甲醛固定液 400 mL 灌注，先快灌 200 mL，继之慢灌 200 mL. 灌注完毕，取出全脑，40 gL-1 多聚甲醛后固
10、定 2 3h 后，将脑放入 200 gL-1 蔗糖溶液，4过夜. 组织块完全沉底后用冰冻切片机连续冠状切片，隔 4 取 1，片厚 50 m. 1.2.2 免疫组织化学染色将脑片经 10 mmolL-1 PBS 漂洗，浸入 800 mLL-1 甲醇和 3 mLL-1 过氧化氢封闭 30 min，10 gL-1 牛血清白蛋白、30 mLL-1 羊血清和 3 gL-1 Triton X100 封闭1 h，用 ABC 方法进行免疫组化染色：首先将脑片浸入兔抗 Fos 抗体（13000，Santa Cruz Tec.），室温 24 h；10 mmolL-1 PBS 漂洗 10 min3 次； 再入生物素
11、化的抗兔 IgG 抗体，室温 4 h；10 mmolL-1 PBS 漂洗 10 min3 次；最后入生物素卵白素辣根过氧化物酶复合物（ABC, 1500，Sigma 公司），室温 2 h，10 mmolL-1 PBS 漂洗 10 min3 次. 用硫酸镍铵加强的 DAB蓝色反应法进行呈色反应，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应，贴片，梯度脱水、透明、封片，光镜下观察. 利用图像分析仪（Quantimet 57，Leica公司）计数. 部分切片用做免疫组化方法对照实验，一抗用牛血清白蛋白稀释液替代. 二抗、ABC 复合物同其他免疫组化反应切片，结果未见阳性结构. 统计学处理：各核团 Fo
12、s 阳性细胞数用 xs 表示，当方差齐时，两组均数的比较用 t 检验；当方差不齐时，两组均数的比较用近似法 t检验. 2 结果 对两组大鼠从延髓尾端到端脑的全脑切片进行了观察，Fos 样免疫反应阳性神经元在脑内分布广泛，两组动物脑内的 Fos 阳性细胞的分布模式非常相似，主要有以下诸核团有较明显的 Fos 表达：孤束核、外侧网状核、三叉神经脊束核尾侧亚核、耳蜗核、脑桥核、臂旁外侧核及 KF 核、A1 区、舌下神经前置核、小脑皮质颗粒层、中央灰质腹外侧部、下丘、腹侧被盖区、顶盖前区、下丘脑背内侧核、下丘脑腹内侧核、室旁核、视上核、外侧膝状体核、丘脑室旁核、杏仁核、海马、外侧缰核、4乳头体上核、视
13、交叉上核、中央杏仁核、纹状体、屏状核、外侧隔核、终纹床核、扣带回皮质、新皮质、嗅结节锥体细胞层等. 经过吸氧预处理的大鼠脑内 Fos 表达模式虽然未改变，许多核团 Fos 表达却明显增多、增强，主要见于：孤束核(NST)、最后区、臂旁外侧核（PLB, Fig 1）、三叉神经脊束核尾侧亚核(Sp5C)、被盖腹核(VTg)、中脑导水管周围灰质腹外侧部(PAG)、乳头体上核（SuM, Fig 2）、视上核（SON, Fig 3）、海马(Hi)、下托(S)、杏仁皮质后外侧核(PLCo)、杏仁皮质前核(ACo)、外侧隔核（(LS, Fig 4)、终纹床核(BST, Fig 5)、苍白球(GP)、Call
14、eja 岛(ICj)、枕皮质（Oc, Fig 6）、压后部皮质(RS)、顶皮质(Par)、皮质前/后肢区(FL/HL)和额皮质(Fr)，P0.05. Fos 阳性细胞记数结果见Tab 1. 表 1 大鼠脑区 Fos 阳性细胞记数（略） Tab 1Enumeration of Fos positive cells in the rat brain areas(略) 3 讨论 近来我们研究发现，给大鼠持续 24 h 吸入纯氧，间隔 24 h 后可明显减轻大脑中动脉阻塞所造成的脑缺血，即诱导脑缺血耐受的产生，我们称之为吸氧预处理. 这一方法可不同程度地克服其它预处理方法不足的一面，因此对其机制的研究
15、具有重要的科学意义. 图 1 臂旁外侧核的 Fos 表达（略） Fig 1Fos expression in lateral parabranchial nucleus50（略） A: Control; B: oxygeninhaling preconditioning. 图 2 乳头体上核的 Fos 表达（略） Fig 2Fos expression in supramammillary nucleus 25（略） A: Control; B: oxygeninhaling preconditioning . 图 3 对照组视上核的 Fos 表达（略） Fig 3Fos expression
16、 in supraoptic nucleus 50（略） 5A: Control; B: Oxygeninhaling preconditioning. 图 4 外侧隔核的 Fos 表达（略） Fig 4Fos expression in lateral septal nucleus 50（略） A: Control; B: oxygeninhaling preconditioning . 图 5 终纹床核的 Fos 表达（略） Fig 5Fos expression in bed nucleus of stria terminalis25（略） A: Control; B: Oxygeninhaling preconditioning. 图 6 枕皮质的 Fos 表达（略） Fig 6Fos expression in occipital cortex25（略） A: Control; B: Oxygeninhaling preconditioning. 目前的各种预处理方法是在研究脑缺
