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1、1单纯疱疹病毒 2 型糖蛋白 G 的基因扩增、 克隆及其 B 细胞抗原表位分析作者：王茜，曾抗，孙乐栋，周再高，刘凤岩 【关键词】 单纯疱疹病毒 2 型；包膜糖蛋白 GGene cloning and B cell antigen epitope analysis of HSV2 glycoprotein G【Abstract】 AIM: To clone fulllength glycoprotein G (gG2) gene of herpes simplex virus type (HSV2) and make a forecast to B cell antigen epitope o
2、f gG2. METHODS: The gG2 gene of HSV2 amplified by PCR was inserted into pGEMT carrier, then transected into E.coli DH5 cells for sequencing. Then, B cell antigen epitope was analyzed by Lasergene, Clustal X softwares. RESULTS: We have cloned fulllength gG2 gene of HSV2. By making an analysis to B ce
3、ll epitope of gG2, we found that the homology in Nterminal of gG1 and gG2 genes of HSV was very low. B cell antigen epitope of gG2 of HSV2 showed a very high antigen index in “peculiarity domain“. CONCLUSION: The successful cloning of fulllength gG2 of HSV2 and a successful forecast to B cell epitop
4、e of gG2 provide evidences and references for developing diagnostic kits for herpes virus infection and finding better target sites of HSV2 vaccine.【Keywords】 herpes simplex virus type ; glycoprotein G2; genes cloning; epitope【摘要】 目的：克隆单纯疱疹病毒 2 型（HSV2）糖蛋白 G2(gG2)全长基因并对糖蛋白 G2 进行 B 细胞抗原表位预测. 方法：用 PCR
5、法扩增 HSV2 的 gG2 基因，连接到 pGEMT 载体，转化大肠杆菌 DH5 株后测序. 利用 Lasergene，Clustal X 等软件，进行 B 细胞抗原表位预测. 结果：完成单纯疱疹病毒 2 型（HSV2）gG2 全长基因克隆. 通过 B 细胞抗原表位分析，发现 HSV1 的 gG1 和 HSV2 的 gG2 氨基端的同源性很低. gG2 蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位. 结论：成功构建单纯疱疹病毒 2 型（HSV2）gG2 全长基因克隆，为单纯疱疹病毒感染的诊2断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.【关键词】 单纯疱疹病毒 2
6、型；包膜糖蛋白 G2；基因克隆；抗原表位0 引言单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是引起人类病毒性疾病中常见的病毒之一，可分为 HSV1 和 HSV2 两种血清型. HSV2 型主要感染外生殖器和躯干下部皮肤，引起生殖器疱疹、新生儿疱疹. 目前认为与生殖器恶性肿瘤相关，并增加了 AIDS 的感染机会1. HSV2 病毒颗粒中至少有 11 种包膜糖蛋白，其中 gG2 为型特异性抗原2，在单纯疱疹 2 型病毒诊断、分型和疫苗研究中起到重要作用. 我们对 HSV2 的 gG2 基因进行克隆，并利用生物信息学软件对 gG2 基因进行 B细胞抗原表位分析，为 gG2 蛋白作
7、为诊断试剂和疫苗研究打下基础.1 材料和方法1.1 材料 HSV2 病毒株由本课题组在广东地区单纯疱疹感染患者中分离培养并感染于 Vero 细胞中保存，Vero 细胞、DH5 细胞由本实验室保存. DNAzsolE， DNA 纯化试剂盒购自申能博彩公司，ExTaq 酶、dNTP 购自 TaKaRa 公司，pGEMT 载体购自 Promega 公司.1.2 方法1.2.1 引物设计根据 GenBank 提供的 HSV2 病毒（Genbank access number: Z86009）基因组全序列，利用 LasergenePrimerSelect 软件设计引物. 上游的引物序列是 5AAGCTT
8、ACCTTGCCGCCCGGCGTCA3；下游的引物序列是5GCGGCCGCTTATCGTGGACATTTGGTCG3. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成.31.2.2DNA 提取采用 DNAzsolE 从 HSV2 病毒 Vero 细胞培养上清中提取 DNA.1.2.3gG2 基因的扩增使用 TaKaRa 公司 ExTaq 酶进行 PCR. 反应液包括：2.5 mmol 的 dNTPs 3 L，10PCR buffer 3 L，上游引物 1 L，下游引物 1 L，ExTaq 0.5 L，cDNA 模板 5 L，H2O 16.5 L，总体积 30 L. 反应条件：94，2 min；94，30
9、 s，55，1 min，72，2 min，30 个循环；72 8 min，4保存.1.2.4 基因克隆使用申能博采公司 DNA 纯化试剂盒回收 PCR 产物，将回收产物与 pGEMT 载体连接， 4放置 12 h. 将重组载体转化 DH5 感受态细胞，于氨苄青霉素抗性固体 LB 培养基上 37培养 16 h，利用 XGal 和 IPTG 筛选阳性重组克隆. 获得的阳性克隆菌扩大培养，提取质粒分别经 PCR 和双酶切初步鉴定，送TaKaRa 公司测序. 利用 protean 软件对 HSV2 病毒 gG2 基因以及 HSV1 病毒gG1 基因进行 B 细胞抗原表位分析，并比较这两型单纯疱疹病毒糖
10、蛋白 G 之间的异同. 2 结果2.1HSV2 病毒 gG2 基因扩增结果取确诊生殖器疱疹病毒感染者分泌物接种Vero 细胞，约 6 d 发生病变后，取上清提取 DNA，用设计的引物进行 PCR，经 7 g/L 琼脂糖凝胶电泳可见一约 2191 bp 的片段，与 HSV2 标准株的 gG2 基因大小一致（图 1）. 将上述 PCR 产物纯化回收后（图 1），与 pGEMT 载体连接，转化DH5 感受态细胞，利用蓝白斑菌落筛选阳性重组克隆. 对阳性克隆扩大培养，提取质粒进行 PCR 和双酶切初步鉴定，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带大小约2191 bp，阳性克隆质粒双酶切后电泳出现两条带， 一条
11、大小约 2191 bp，另一条大小位于 3000 bp（图 2），与预期结果完全一致.4M: DNA Marker, DL15000；1：HSV2 的 gG2 基因 PCR 扩增产物；2：纯化的 gG2基因；3：DNA Marker DL2000.图 1 扩增的 HSV2 gG2 基因的电泳（略）2.2 序列测定及 B 细胞抗原表位鉴定后的阳性克隆进行序列分析发现，阳性克隆质粒中 gG2 基因测序结果与 GenBank 中国际标准株序列同源性有 99.52. 将基因序列翻译成氨基酸序列，根据序列分析结果，采用 PolyKyteDoolittl 亲水性、PoltEmini 表面可能性、James
12、onWolf 抗原指数三参数综合预测方案预测，结果表明， HSV2 病毒 gG2 蛋白中存在 7 段抗原指数以及表面可能性强的肽段相对集中区域. 分别是 5074, 134160, 285410, 437482, 523605, 615637, 678688，其中 314338, 352367, 447482, 527544, 550562, 570578, 585600, 615625, 678688 肽段为最有代表性的肽段（图 3,4）.M: DNA Marker DL15000； 1：pGEMT 载体 gG2 基因重组质粒结果；2：pGEMT 载体 gG2 基因重组质粒 Hind单酶切结
13、果；3：pGEMT 载体 gG2 基因重组质粒 Hind/Not I 双酶切结果.图 2HSV2 gG2 基因重组克隆的鉴定（略）图 3HSV2 gG2 蛋白 B 细胞表位分析（略）图 4HSV2 和 HSV1 gG2 蛋白 B 细胞表位比较分析（略）3 讨论HSV2 包膜糖蛋白 gG2 由 US4 基因编码 699 个密码子，包括一个与 HSV1 包膜糖蛋白 gG1 基因高度同源的区域和一个“独特区”3. 通过对 gG1 蛋白和 gG25蛋白的比对以及 B 细胞抗原表位的预测我们发现，gG1 和 gG2 基因在“独特区”中的同源性非常低（图 4）. gG2 蛋白中存在 7 段抗原指数以及表面
14、可能性强的肽段相对集中区域. 分别是 5074, 134160, 285410, 437482, 523605, 615637, 678688，其中 314338, 352367, 447482, 527544, 550562, 570578, 585600, 615625, 678688 肽段为最有代表性的肽段. Grabowska 等4利用噬菌体展示技术发现，两个位于 gG2“独特区”内的免疫显位在氨基酸残基的 351427, 525587内，并通过试验证明这两段氨基酸残基只与 HSV2 型单纯疱疹病毒反应而不与HSV1 型单纯疱疹病毒反应. Ikoma 等5利用杆状病毒表达系统表达gG2
15、（281aa594aa），检测 HSV2 型感染患者血清特异性抗体，特异性和敏感性达到 95.5. 由此说明这两段区域的肽段适合用于临床抗体检测，尤其适合用于HSV2 分型诊断. Liljeqvist 等6研究发现6，HSV2 的 gG2 基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱 gG2 的血清学活性. 同时进一步证实 gG2基因可以作为型特异性抗原，同时指出 gG2 基因的保守性是作为 HSV2 特异疫苗成分的先决条件.我们成功扩增和克隆了 HSV2 型 gG2 全长基因片段，并通过 B 细胞抗原表位预测出 gG1 和 gG2 蛋白的同源性区域在 gG1 蛋白 157239 肽段
16、和 gG2 蛋白615699 肽段，其同源性达到 70以上，是 HSV 病毒高度保守的区域. 在 HSV2的 gG2 蛋白的“独特区”存在 7 段抗原指数很强的氨基酸区段. 本研究为单纯疱疹病毒 2 型感染的诊断试剂的研发，抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供参考.【参考文献】1 孙乐栋,周再高,曾抗,等. 性乱人群中单纯疱疹 2 型病毒感染情况及丽珠威的疗效观察J. 第一军医大学学报,2001，21（10）：769.62 周建勋. 单纯疱疹病毒型（HSV2）包膜糖蛋白 G2 相关研究进展J. 国外医学病毒学分册, 2004,11(4)：123-126.3 Gorander S, Svennerholm B, Liljeqvist JA, et al. Secreted portion of glycoprotein G of herpes simplex virus ty
