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1、1vWF 和 HDAC1 在胃癌细胞株 BGC823 中 的表达及对细胞粘附侵袭迁移能力的影 响作者：王敏，刘伟，杨爱军，王晨昱，李敏【摘要】 目的：研究血管性血友病因子（vWF）及组蛋白去乙酰化酶 1（HDAC1）在人胃癌细胞株 BGC 823 中的表达及对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响，并探讨其机制. 方法：体外培养人胃癌细胞株 BGC 823，分别以 vWF 抗体（vWF Ab）及HDAC1 抗体(HDAC1 Ab)作用处理；用 RT PCR 和免疫细胞化学方法检测细胞中 vWF 和 HDAC1 的表达及相互作用. 噻唑兰比色（MTT）法检测对细胞外基质成分 型胶原粘附能力的变化；Boy
2、den 小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变. 结果：BGC 823 细胞能够表达 vWF 和 HDAC1；经 HDAC1 Ab 处理后，细胞中vWF mRNA 相对含量由处理前的 0.2134 增加到 0.3214，vWF 蛋白表达增强；vWF Ab 处理组细胞的粘附率较未处理组明显下降（P0.01）；vWF Ab 处理组细胞侵袭、迁移穿膜细胞数分别为 54.869.94 和 60.4716.20，与空白对照组相比较差异具有统计学意义（P0.01）. 结论：人胃癌细胞株 BGC 823 能够表达 vWF 及 HADC1；HDAC1 可调节 vWF 的表达；vWF 在 BGC 823 细胞的粘附
3、、侵袭及迁移过程中起重要促进作用. 【关键词】 胃肿瘤；细胞系，肿瘤；von willebrand 因子；组蛋白去乙酰化酶 1；肿瘤转移【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and effects on adhesion, invasion 2and motility of von Willebrand factor (vWF) and histone deacetylase 1 (HDAC1) in human gastric cancer cell line BGC 823 in vitro and the related mecha
4、nism of anti metastasis. METHODS: Human gastric cancer cell line BGC 823 cultured in vitro were treated respectively with vWF antibody (vWF Ab) and HDAC1 antibody (HDAC1 Ab). The expressions of vWF and HDAC1 in BGC 823 were detected by RT PCR and immunocytochemistry. The effects of vWF and HDAC1 on
5、the adhesion, invasion and motility of human gastric cancer cell line BGC 823 in vitro were explored respectively by MTT colorimetric assay and Boyden chamber. RESULTS: The human gastric cancer cell line BGC 823 expressed vWF and HDAC1. After treatment with HDAC1 antibody, the expression level of vW
6、F mRNA in BGC 823 was increased from about 0.2134 to 0.3214, and the expression of vWF protein was increased. Compared with the control group, the adhesion, invasion (54.869.94) and motility (60.4716.20) abilities of the BGC 823 cells were decreased significantly (P0.01) after treatment with vWF ant
7、ibody. CONCLUSION: Human gastric cancer cell line BGC 823 can express vWF and HDAC1, and the expression of vWF can be regulated by HDAC1. vWF takes an important part in the adhesion, invasion and motility of the BGC 823 cells.【Keywords】 stomach neoplasms; cell line, tumor; vWF; HDAC1; neoplasm metas
8、tasis0 引言血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）生理状态下参与凝血的发生，但目前临床研究报道其与结肠癌1、骨肉瘤2和恶性黑色素瘤3等肿瘤的转移也有密切关系. 组蛋白去乙酰化酶 1（histone deacetylase，HDAC1）作为调控基因的关键酶，参与了 vWF 的转录调节4，其功能异常也被证实与恶性肿瘤的发生和发展有关5. 截至目前，关于 vWF 和 HDAC1 对胃癌细胞转移能力影响的体外研究尚少见报道. 我们以胃癌细胞 BGC 823 为研究对象，采用 vWF 抗体及HDAC1 抗体进行体外干预，观察 vWF 和 HDAC1 的表达、相互作用
9、和对细胞粘附、侵袭、迁移能力的影响，并初步探讨其作用机制.1 材料和方法1.1 材料 RPMI 1640（美国 Gibco 公司）；胰酶(美国 Amresco 公司)；超级新生3牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程有限公司）；型胶原（兰州大学病理研究所自制）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）及牛血清白蛋白（BSA）（美国 Sigma 公司）；兔抗人vWF 多克隆抗体（Ab6994，英国 Abcam 公司）；兔抗人 HDAC1 多克隆抗体（BA0914）及 SP 免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Trizol 试剂、RT PCR 两步法试剂盒及焦碳酸二乙酯(DEPC)（上海生物工程有限公司）
10、；目的基因、内参引物及 Marker（D512A）（TakaRa）；博伊登(Boyden)小室与多聚碳酸酯膜(8.0 m 孔径)（美国 Millipore 公司）；人胃癌细胞株 BGC 823（中国科学院上海细胞生物研究所）.1.2 方法1.2.1 细胞培养 用含 100 mL/L 灭活新生牛血清的 RPMI 1640 培养液（含105 U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素）在 37 50 mL/L CO2 及饱和湿度的培养箱中维持培养.1.2.2 SP 法免疫细胞化学染色 取对数生长期 BGC 823 细胞，消化离心后，将细胞悬液加入已预置无菌小玻片的 12 孔板中，每孔含细胞 2104
11、 个，培养 36 h后，取出盖玻片，PBS 洗 3 次，4无水乙醇固定. 免疫组化参照试剂说明书进行，苏木精轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果. PBS 代替一抗做阴性对照. 判断标准：HDAC1 以细胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞，vWF 以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞.1.2.3 RT PCR1.2.3.1 细胞处理 实验分为对照组：无任何干预，细胞在 37 50 mL/L CO2 条件下培养 48 h 后检测 vWF mRNA 及 HDAC1 mRNA 表达；vWF Ab 处理组：用20 g/mL vWF Ab 作用细胞 48 h 后，检测 HDAC1 mRNA 表达；HDAC1 A
12、b 处理4组：用 10 g/mL HDAC1 Ab 作用细胞 48 h 后，检测 vWF mRNA 表达.1.2.3.2 两步法 RT PCR 用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，参照 AMV 第一链cDNA 合成试剂盒说明书操作合成 cDNA，以 Oligo dT 为引物反转录，vWF 及HDAC1 特异引物进行 PCR 扩增，vWF 的引物序列为，上游 5 ATAGGAGCACACCCCTTGC 3，下游 5 CACTTTGTCGCCCATTATCC 3，大小为 141 bp；HDAC1 的引物序列为，上游 5 CTCTCCAGCTCTGGCTTCC 3，下游5 AGACCTGGCA
13、CCCTTTATGG 3, 大小为 234 bp；以 GAPDH 为内参照，引物序列为，上游 5 TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3，下游 5 GTACATGGTATTCACCACCC 3，大小为 456 bp. 反应条件：vWF 及 GAPDH 条件一致：94变性 4 min, 94 30 s, 52 40 s, 72 50 s,共循环 36 次后 72延伸 5 min；HDAC1 为 94变性 4 min, 94 30 s, 54 40 s, 72 50 s，共循环 45 次后72延伸 5 min. 扩增产物进行 1.5 g/L 琼脂糖凝胶电泳，电泳图像经凝胶成像扫描仪分析，比较
14、vWF 和 HDAC1 相对表达量.1.2.4 粘附抗体抑制实验 分别将 20 g/mL vWF Ab 和 10 g/mL HDAC1 Ab加入 RPMI 1640 培养基中，与 BGC 823 细胞共培养 48 h；将 96 孔板预先用 3 gmL 型胶原 20 L孔包被，20 mL/L BSA 封板处理，加入调好的细胞悬液200 L孔（5105 个mL）；CO2 培养箱分别孵育 30，60，90 和 120 min 后，弃去培养液，PBS 冲洗除去未粘附细胞；弃 PBS 后加入 MTT 20 L，及无血清RPMI 1640 200 L，CO2 孵育 3 h；吸弃培养孔内上清液，加入二甲基亚
15、砜（DMSO） 200 L 溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪 570 nm 处测各孔吸光度（A570 nm）值，同时设立相应的 RPMI 1640 培养对照组. 各组重复 3 次.51.2.5 体外侵袭抑制实验 分别将 20 g/mL vWF Ab, 10 g/mL HDAC1 Ab 和vWF Ab 及 HDAC1 Ab 混合液加于无血清 RPMI 1640 培养基中，与 BGC 823细胞共培养 48 h，对照组不做抗体处理；在 Boyden 小室的下室加入含有 500 mL/L FBS 的培养液 200 L，上下室之间用孔径 8 m 的聚碳酸酯膜分开，膜上均匀铺浓度为 3 gmL 的型胶原
16、 50 L室，将小室置于 37温箱中聚合 30 min. 上室内加入预处理的细胞悬液 200 L室（含 2105 个细胞），37 50 mL/L CO2条件下放置 48 h. 弃上室液体，用棉签擦掉膜上未侵袭细胞及胶，PBS 洗 3 次，950 mL/L 乙醇固定 15 min，常规 HE 染色. 结果判定：在 400 倍光镜下每个滤膜分别计数 5 个视野的穿膜细胞数，计算平均每个视野的细胞数. 实验组和对照组重复 3 次. 按下式计算抗体作用对细胞侵袭的抑制率(IR): IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)100%.1.2.6 体外迁移抑制实验 细胞处理同侵袭实验，聚碳酸酯膜表面不铺胶，其余步骤同侵袭实验. 通过计数穿膜细胞数反映 vWF 及 HDAC1 对 BGC 823 细胞体外迁移能力的影响. 按下式计算抗体作用对细胞迁移的抑制率(IR): IR (%)=(1-实验组平均迁移细
