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1、质粒 DNA 的提取、纯化和检测姓名：郑小煜 学号：201100140069 班级：2011 级生技班 组别：第二组 同组者：赵莉、高瑞一、一、实验目的实验目的1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性提取法提取质粒 DNA 的方法。 3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 4、掌握凝胶的观察方法，并学会分析。二、二、实验原理实验原理1、质粒(plasmid) 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,为双链、闭合环状的 DNA 分 子，并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转 录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带
2、的遗传 信息。 质粒的存在使宿主细胞具有一些额外的特性，如 对抗生素的抗性 等。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型： 严紧控制型（Strengent control）：复制受宿主细胞的严格调控， 拷贝数低； 松弛控制型（Relaxed control）：复制不受宿主细胞的调控，拷 贝数高，适用于基因工程中做载体。 2、提取和纯化质粒 DNA 的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、 煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard 法 等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒 DNA 的提 取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒 DNA
3、纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度 离心法，主要适用于相对分子质量与染色体 DNA 相近的质粒，具有纯 度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒 DNA 多为超螺旋构型等优点， 但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒 DNA 还可以用沸水 浴法、Wizard 法等，沸水浴法提取的质粒 DNA 中常含有 RNA，但不影 响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及链接反应等。 3、碱变性提取质粒 DNA 一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增 质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒 DNA。 4、在细菌细胞中，染色体 DNA 以双螺旋结构存在，质粒 DNA 以共价 闭合环状形式
4、存在，细胞破碎后，染色体 DNA 和质粒 DNA 均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液 pH 值不同。在 pH 值高达 12.0 的碱性溶液中，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性;共价 闭合环状质粒 DNA 的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离.当用 pH 值 4.6 的 KAc(或 NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒 DNA 可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中; 但染色体 DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子 RNA、蛋白质一 SDS 复合物等 一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的 溶于溶液的质粒 DNA 分
5、离。溶于上清液的质粒 DNA，可用无水乙醇和 盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于 DNA 与 RNA 性质类似，乙醇沉淀 DNA 的同时，也伴随着 RNA 沉淀，可利用 RNase A 将 RNA 降解。质粒 DNA 溶液中的 RNase A 以及一些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去， 苯酚、氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起 到消除抽屉过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以 除去残留的氯仿。然后用 75%以纯溶液洗涤沉淀，一出去残留的盐离子。 最后获得纯度较高的质粒 DNA 贮存在 TE 溶液中，-20保存。 5、电泳(electrophoresis)是带电
6、物质在电场中向着与其电荷相反的电极 方向移动的现象。各种生物大分子在一定 pH 条件下，可以解离成带电 荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核 心技术之一。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的 凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大 小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各 种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片 段。 6、凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外， 凝胶中 DNA 的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或
7、SYBR Gold 染色直接观察到，甚至含量少至 20pg 的双链 DNA 在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的 DNA 条带 可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验. 7、分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝 胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构 型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸 (5500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差 1bp 或质量上相差 0.1%的 DNA 都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝 胶电泳进行 DNA 序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并
8、能容纳较大的 DNA 上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上 繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由 -D-吡喃半乳糖与 3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为 104-105。琼脂糖加热至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为 40-45。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低， 但它的分离范围更大(50 至百万 bp)，小片段 DNA(50-20000bp)最适合在 恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝 胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定 DNA 的相对分子质量，分离 经限制酶水解的 DNA 片段，进一
9、步纯化 DNA 等。8、琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。核酸在溶液中由于它们有磷酸 基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳迁速 率主要取决于下面 6 个因素： （1）样品 DNA 分子的大小：电泳时，线性双螺旋 DNA 分子是以头 尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量（所含碱基）的 对数值成正比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA 分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的 DNA 分子，其迁移速率不同。在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种因素的 影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA（covalently closed circular DNA，c
10、ccDNA）的一条链断裂，变成开环 DNA（open circle DNA，ocDNA）分子，如果两条链发生断裂， 就转变为线状 DNA（liner DNA，L DNA）分子。这三种构型的 分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快， 其次为线状分子，最慢的是开环分子。 （3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的 DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝 胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA 电泳迁移速度越快，因此， 相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。 （4）电泳所用电场：低电压条件下，线性 DNA 片段的迁移速率与 所用电压成正比，电压越高，带
11、电颗粒泳动越快，但随着电场 强度的增加，不同长度 DNA 泳动的增加程度不同，因此凝胶 电泳分离 DNA 的有效范围随着电压上升而减少。为了获得 DNA 片段的最佳分离效果，电场强度应小于 5V/cm。 （5）缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液 为去离子水（如不慎误用去离子水配置凝胶） ，溶液的导电性 很少，带电颗粒涌动很慢，DNA 几乎不移动；而在高离子强度 下（如错用 10*电泳缓冲液） ，导电性极高，带电颗粒泳动很 快，产生大量的热，有时甚至融化凝胶或使 DNA 变性。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐(TAE)、硼酸盐(TBE)和磷酸 盐(TPE)几种不同的电泳缓冲液，通常
12、配成 10或 5的浓缩母 液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。电泳缓冲液的工作浓 度约 50 mmolL，工作 pH 在 7578 之间。TAE 缓冲液 缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失(阳极变碱性，阴 极变酸性)，长时间电泳需要更换缓冲液；TBE、TPE 缓冲液缓 冲能力较强，可以重复使用数次。TAE 缓冲液可以分离数 kb 长度的 DNA，在精制 DNA 片段以及染色体 DNA 进行杂交时比 较常用。相反，TBE 缓冲液适于鉴定、分离短小的 DNA 片段。（6）温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小 DNA 片段的相对电泳迁 移率在 4-30C 内无变化,一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进 行
13、,而当琼脂糖含量少于 0.5%时,凝胶很脆弱,最好在 4C 下电 泳以增加凝胶强度。9、DNA 分子量 MarkerSupercoiled DNA Ladder Marker (浓度 : 500 ng/ 6l ) Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8 种超螺旋的质粒 DNA 构成， DNA Size 大小分别为: 2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中 2 kbp6 kbp 间约以 1 kbp 递增，6 kbp12 kbp 间约以 2 kbp 递增。每
14、次取 6 l 电泳时，每条 带的 DNA 量约为 50 ng，其中 5 kbp 条带的 DNA 量约为其他条带的 3 倍 (150 ng)，显示亮带。此 DNA 溶液中已含有 1 Loading Buffer，可 直接上样。1 Loading Buffer 中含有色素 Xylene Cyanol FF (0.01%) 以 及 Bromophenol Blue (0.01%)。 三、三、主要仪器和材料试剂主要仪器和材料试剂1、仪器和材料恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL 离 心管，50mL 离心管，不同型号的吸头、微量移液枪，平板，接种环，酒精 灯，量筒，微波炉，电泳
15、仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf 管，记号笔等。 2、菌体E.coli DH5 受体菌，具有 Ampr 标记的质粒 pUC19。 试剂LB 培养基，抗生素（氨苄青霉素） ，溶液（50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/LTris-Hcl，10mmol/LEDTA） ，溶液（0.2mol/L NaOH,1%SDS，现 配现用） ，溶液（5mol/LKAc 60ml,冰醋酸 11.5ml，重蒸水 28.5ml） ， RNase A 母液，TE 缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇 （PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE 电泳缓冲液（10
16、） ，上样缓冲液 （6） ，琼脂糖，溴化乙锭(EB), DNA 相对分子质量标准物 DNA Marker kHind，5 molL pH 52 的醋酸钠，无水乙醇。四、四、实验步骤实验步骤（一）涂布平板 1、 配制 2 瓶 LB 培养基。 2、 1 瓶 LB 中加氨苄，另一瓶不加氨苄。分别倒平板。 3、 两个平板均分为 2 半，一半涂布携带有质粒 pUC19 的 E.coli 菌 落，另一半涂布不携带有质粒 pUC19 的 E.coli 菌落。 4、 37C 培养。 （二）细菌培养 1、在含有氨苄青霉素的 LB 平板上挑取携带有质粒 pUC19 的 E.coli 单 菌落，接种于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37C 振荡培 养过夜。 2、将过夜培养物以 2%接种量接种到 50ml 含有氨苄青霉素（终浓度 80- -100g/mL）的 LB 液体培养基中，37C160r/min 振荡培养过夜或 至对数生长晚期。 （三）质粒 DNA 提取 1、取 30mL 菌液于 50mL 灭菌
