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1、生命科学与技术学院生化实验（下）1生生 物物 化化 学学 实实 验（下）验（下）实验三实验三 离子交换柱层析法分离氨基酸离子交换柱层析法分离氨基酸华中科技大学生命科学与技术学院2012 级生物化学小老师 第三组生命科学与技术学院生化实验（下）2离子交换柱层析法分离氨基酸【实验目的】1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。2.掌握离子交换柱层析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。【实验原理】1.离子交换层析原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH 等，因此可以和溶液中的离子
2、产生交换反应，如：这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸” ，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。其中使用的最普遍的是离子交换树脂。由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。生命科学与技术学
3、院生化实验（下）3选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732 型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH值。在 pH5.3 条件下，因为 pH 值低于 Lys
4、 的 PI 值，Lys 可解离成阳离子结合在树脂上；Asp 可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在 pH12 条件下，因 pH 值高于 Lys的 pI 值 Lys 可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的 pH 值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2.茚三酮反应机理茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮黄色）化合物的反应。该紫色化合物在 570nm 处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。由于该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析，国内的大部分教材认为其反应机理为：生命科学与技术学院生化实验（
5、下）4但是大量实验表明而且大部分的学者认为茚三酮显色反应生成的有色物质是混合物而不是单一组分。茚三酮显色反应受 pH，茚三酮试剂的配制方法和浓度，氨基酸种类和浓度，反应温度，反应时间，冷却时间，离子强度等都有较大影响。特别要注意的是 pH 对显色反应的影响特别大，且该反应在一个小时内稳定。【实验器材和试剂】一、实验器材层析柱（20cm*1cm） ；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管；玻璃棒；烧杯；试管架。二、实验试剂732 型阳离子交换树脂（100-200 目）2mol/L 氢氧化钠溶液，1mol/L 氢氧化钠溶液；2mol/L 盐酸溶液，0.1mol/L 盐酸溶
6、液；标准氨基酸溶液天冬氨酸、赖氨酸均配制成 2mg/mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液；洗脱液柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（pH5.3）取柠檬酸 14.25g，氢氧化钠 9.30g 和浓盐酸 5.25mL 溶于少量水后，定容至 500mL，冰箱保存注：在柠檬酸缓冲液中加入 0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲溶液用的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在 4保存。0.01mol/LNaOH 溶液（pH12）取 0.4gNaOH 固体用适量蒸馏水溶解后，定容至 1L显色剂生命科学与技术学院生化实验（下）5取 0.5g 茚三酮溶于 75mL 乙二醇单甲醚中，加水定容至 10
7、0mL。待测样品混合氨基酸溶液：将 2mg/mL 天冬氨酸、赖氨酸溶液按 1:2.5 的比例混合，混合后再以 1:1的比例用 0.1mol/L 盐酸溶液稀释。【操作步骤】1.树脂的处理对于市售干树脂，先是经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加 4倍量的 2mol/LHCl 溶液浸泡 1 小时，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用 2mol/LNaOH溶液处理，做法同上。以 1mol/LNaOH 溶液浸泡树脂一小时转化为钠型，用蒸馏水洗至中性，最后用欲使用的柠檬酸缓冲液浸泡，过剩的树脂浸入 1mol/LNaOH 溶液中保存，以防细菌生长。2 装柱取层析柱一支，垂直固定在铁架台上，(实
8、验前需进行检漏，小老师会在实验过程中进行演示) 用夹子夹紧柱底出口处橡胶管，在柱内加 23cm 高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入。待树脂在柱底部逐渐沉降时，慢慢打开柱底出口处铁夹，继续加入树脂悬浮液，直至树脂高度到层析柱高度的 3/4 处。注意：要注意装柱过程的连续性，装好的层析柱应均匀，防止产生气泡，节痕或界面，否则会对实验有较大的影响，必须重新装柱；注意不要让树脂颗粒出现在层析柱管口，以免漏气。3 平衡层析柱装好后，再缓慢沿管壁加入 适量缓冲液至树脂床面以上 23cm 处，接上横流泵，用柠檬酸缓冲液以 0.5mL/min 的流速进行平衡，用 pH 试纸测量流出液 pH
9、，直至流出液的pH 与缓冲液的 pH 相等。注意：调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速，影响实验效果。调节流速时统一将流速调节为 10 滴/min,平衡时间一般为 15 分钟。4 加样关闭恒流泵，打开层析柱上端管口，缓慢打开柱底出口，小心放出层析柱内的液体至柱内液体的凹液面恰好与树脂上液面相齐，立即关闭下端出口（注意：不要使液面下降至树脂表面以下） 。用移液枪吸取氨基酸混合样品 0.5ml，沿靠近树脂表面的管壁缓慢加入，注生命科学与技术学院生化实验（下）6意不要冲坏树脂表面。加样后打开柱底止水夹，使液体尽可能缓慢地流下至液体凹液面恰与树脂表面相平，立即关闭止水夹。再用胶头
10、滴管吸取 0.5ml 缓冲液清洗柱内壁，打开止水夹放出液体，使液体下表面与树脂表面相平，按照此法清洗 2 次。然后小心加入缓冲液离柱顶部 1cm 为止，并将层析柱与恒流泵和部分收集器相连。注意：样品体积不要过大，样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。 5.洗脱 缓冲液洗脱：用柠檬酸缓冲液（pH5.3）以 6s/滴的流速开始洗脱，用试管收集洗脱液，每管收集 1ml，收集 1-10 号管。( 0.01mol/L NaOH 溶液（pH12）洗脱：关闭恒流泵和止水夹，将柠檬酸缓冲液更换为0.01mol/L 的 NaOH 溶液，打开止水夹进行洗脱，同法收集 11-40 管。收集完毕后
11、，关闭止水夹和恒流泵。注意：在整个实验过程中要多注意层析柱，避免使柱内液体流干，否则实验即为失败，并且一定要让出液口对准试管，留心观察，有些仪器有偏差。6.测定分别向 60 管收集液中加入 1.5ml 柠檬酸缓冲液，混匀后再加入 1ml 茚三酮显色剂，混匀。沸水浴 15min 后取出，冷却至室温，在 1h 内用分光光度计在 570nm 下以蒸馏水为空白管进行比色，测定各管的吸光度值。注意：比色时尽量避免将液体沾在手上或衣服上。7.树脂再生层析柱使用几次后，需将树脂取出用 1mol/LNaOH 溶液洗涤，再用蒸馏水洗至中性后可反复使用。注意：在本次实验结束之后需将树脂倒至指定烧杯中。【结果与分析】以吸光度值为纵坐标，收集的管数为横坐标，绘制出洗脱曲线。【思考题】1.对于新树脂我们做的处理是先用 2mol/LHCl 搅拌半小时，然后用蒸馏水洗至中性，再用 2mol/LNaOH 搅拌半小时，用蒸馏水洗至中性，最后用 1mol/LNaOH 搅拌半小时，还用 蒸馏水洗至中性。请分析原因。 2.所加树脂的高度为层析柱高度的 3/4，请思考树脂过高或过低对实验结果有何影响，试生命科学与技术学院生化实验（下）7分析原因。 3.本实验加的样品为天冬氨酸和赖氨酸，若再加一个组氨酸，请估计其峰值的位置，说 明理由。
