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1、1选修选修 3 一、 基因工程 1 1、（、（a a）基因工程的诞生）基因工程的诞生 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外体外 DNA 重重组组和和转转基因技基因技术术， ，赋 予生物以新的新的遗传遗传特性特性，创造出更符合人更符合人们们需要的新的生物需要的新的生物类类型和生物型和生物产产品品。基因工程是 在 DNA 分子水平分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重重组组技技术术。 2、（、（a）基因工程的原理及技）基因工程的原理及技术术 原理：基因重组 技术：（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶（限制（限制酶
2、酶） ） （1）来源：主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定特定 部位的两个核苷酸之间的磷酸二磷酸二酯键酯键断开，因此具有专专一一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端黏性末端和平末端平末端。 2.“分子缝合针”DNA 连连接接酶酶 (1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶）的比较： 相同点：都缝合磷酸二磷酸二酯酯键。 区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4噬菌体噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端黏性末端之 间的磷
3、酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端两种末端，但连接平末端的之间的效 率较低低。 (2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单单个核苷酸个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末 端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个两个 DNA 片段片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”载载体体 （1）载体具备的条件：能在受体能在受体细细胞中复制并胞中复制并稳稳定保存定保存。具有一至多个限制具有一至多个限制酶酶切切 点，供外源点，供外源 DNA 片段插入片段插入。具有具有标记标记基因，供重基因，供重组组 DNA 的的鉴鉴定和定和选择选择。 （2）最常用的载体是质质粒粒,
4、它是一种裸露的、裸露的、结结构构简单简单的、独立于的、独立于细细菌染色体之外菌染色体之外，并具，并具 有有自我复制能力自我复制能力的双的双链链环环状状 DNA 分子分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、噬菌体的衍生物、动动植物病毒植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的目的基因的获获取取 1.目的基因是指： 编码编码蛋白蛋白质质的的结结构基因构基因 。 2.原核基因采取直接分离直接分离获得，真核基因是人工合成人工合成。人工合成目的基因的常用方法有 反反转录转录法法_和化学合成法化学合成法_。 3.PCR 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA 双双链链复制复制 （2）过程：
5、第一步：加热至 9095DNA 解解链链；第二步：冷却到 5560，引物引物结结 合到互合到互补补 DNA 链链；第三步：加热至 7075，热稳热稳定定 DNA 聚合聚合酶酶从引物起始互从引物起始互补链补链 的合成的合成。 第二步：基因表达基因表达载载体的构建体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳稳定存在定存在，并且可以遗传遗传至下一代至下一代，使目的基因能够 表达和表达和发挥发挥作用作用。 2.组成：目的基因目的基因启启动动子子终终止子止子标记标记基因基因2（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段片段，位于基因的首端首端，是 RNA 聚合聚合酶酶识别 和结合的部位，能驱动基因转录
6、转录出出 mRNA，最终获得所需的蛋白蛋白质质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段片段 ，位于基因的尾端尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因是否含有目的基因，从而将含有目的基含有目的基 因的因的细细胞胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因抗生素基因。 第三步：将目的基因将目的基因导导入受体入受体细细胞胞_ 1.转化的概念：是目的基因是目的基因进进入受体入受体细细胞内，并且在受体胞内，并且在受体细细胞内胞内维维持持稳稳定和表达的定和表达的过过程。程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农农杆菌杆菌转转化法化法，其次还有
7、基因基因枪枪法法和 花粉管通道法花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显显微注射技微注射技术术。此方法的受体细胞多是 受受 精卵精卵。 将目的基因导入微生物细胞： 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达含有基因表达载载体受体体受体细细胞胞的依据是标记标记基因是否表基因是否表 达达。 第四步：目的基因的目的基因的检测检测和表达和表达 1.首先要检测 转转基因生物的染色体基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分分 子子杂杂交技交技术术。 2.其次还要检测 目的基因是否目的基因是否转录转录出了出了 mRNA，方法是采用 用用
8、标记标记的目的基因作探的目的基因作探针针 与与 mRNA 杂杂交交。 3.最后检测 目的基因是否翻目的基因是否翻译译成蛋白成蛋白质质，方法是从转基因生物中提取 蛋白蛋白质质，用相应 的 抗体抗体进行 抗原抗体抗原抗体杂杂交交。 4.有时还需进行 个体生物学水平个体生物学水平的鉴定。如 转转基因抗虫植物是否出基因抗虫植物是否出现现抗虫性状抗虫性状。 （三）（三）（b b）基因工程的应用）基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆抗虫、抗病、抗逆转转基因植物，利用基因植物，利用转转基因改良植物的品基因改良植物的品质质。 。 2.动物基因工程：提高提高动动物生物生长长速度、改善畜速度、改善畜
9、产产品品品品质质、用、用转转基因基因动动物生物生产药产药物。物。 3.基因治疗：把正常的外源基因把正常的外源基因导导入病人体内，使入病人体内，使该该基因表达基因表达产产物物发挥发挥作用。作用。 （四）（四）（a a）蛋白质工程的概念）蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白蛋白质质分子的分子的结结构构规规律及其生物功能的关系律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修基因修饰饰 或基因合成或基因合成，对现有蛋白质进行改造改造，或制造一种新的蛋白新的蛋白质质，以满足人类的生产和生 活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在自然界已存在的蛋白质）（1）蛋白质工程崛 起的缘由：基因工程只能生产自然界
10、已存在的蛋白质基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质 （2）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二 代的基因工程。 基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列， 找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工 程的一般步骤进行。程的一般步骤进行。 （注意：目的基因只能用人工合成的方法）（注意：目的基因只能用人工合成的方法） 设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列 二、细胞工程 （一）植物
11、细胞工程 1.理论基础（原理）：细细胞全能性胞全能性 2.植物组织培养技术（植物组织培养技术（b b）3（1）过程：离体离体的植物器官、组织或细胞 愈愈伤组织伤组织 试管苗 植物体 （2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单单倍体育种、倍体育种、细细胞胞产产物的工厂化生物的工厂化生产产。 A 植物繁殖 微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖 作物脱毒：采用茎尖茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有植物分生区附近的病毒极少或没有） 人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜 包装得到的种子。优点：完
12、全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和 运输运输 B 作物新品种培育 单倍体育种： a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab 四种类型） ；对花粉 进行花药离体培养（技术是植物组织培养）花药离体培养（技术是植物组织培养） ；得到单倍体植株单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水秋水 仙素仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb 四种类型） 。 b 优点：明显缩短育种年限 C 突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如如 筛选抗病、抗
13、盐、含高蛋白的突变体筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） D 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们 能够产生大量的细胞产物。 （3）地位：是培育转转基因植物基因植物、植物体植物体细细胞胞杂杂交交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体 细胞杂交 技术 （1）过 程：（2）诱 导融合的方法：物理法包括离心、振离心、振动动、 、电电刺激刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（聚乙二醇（PEG） ）作 为诱导剂。 （3）意义：克服了克服了远缘杂远缘杂交不交不亲亲和的障碍。和的障碍。 （二）动物细胞工程1.1. 动物细胞培养（动物细胞培养（a a） （1）概念：动物细胞培
14、养就是从动物机体中取出相关的组织组织，将它分散成单单个个细细胞胞， 然后放在适宜的培养基培养基中，让这些细胞生生长长和繁殖和繁殖。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动动物胚胎或幼物胚胎或幼龄动龄动物的器官或物的器官或组织组织）剪 碎用胰蛋白胰蛋白酶酶或胶原蛋白或胶原蛋白酶酶处理分散成单单个个细细胞胞制成细细胞胞悬悬液液转入培养瓶中进行植物细胞 A植物细胞 B杂种细胞愈伤组织杂种植株图（2）4原代原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传传代代 培养。 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴贴附在瓶壁上附在瓶壁上，称为细胞贴壁细胞贴壁。 细胞数目
15、不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖停止分裂增殖， 这种现象称为细细胞的接触抑制胞的接触抑制。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 无菌、无毒的无菌、无毒的环环境境：培养液应进行无菌无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生抗生 素素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代代谢产谢产物物积积累累对细对细胞自身胞自身 造成危害造成危害。 营营养养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加 入血清、血血清、血浆浆等天然成分。 温度温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.536.50.50.5；pH：7.27.27.47.
16、4。 气体气体环环境境：95%空气空气5%COCO2 2。O2是细细胞代胞代谢谢所必需的，CO2的主要作用是维维持培养液持培养液 的的 pH。 （5）动物细胞培养技术的应用：制制备备病毒疫苗、制病毒疫苗、制备单备单克隆抗体、克隆抗体、检测检测有毒物有毒物质质、培养、培养 医学研究的各种医学研究的各种细细胞。胞。 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为胚胎胚胎细细胞胞核移植（比较容易）和体体细细胞胞核移植（比较难） 。 （2）选用去核卵卵(母母)细细胞胞的原因：卵(母)细胞比比较较大，容易操作大，容易操作；卵(母)细胞细细胞胞质质多，多， 营营养丰富养丰富。 （3）体细胞核移植的大致过程是： 高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中减二分裂中 期的卵母细胞期的卵母细胞，去核（显微操作）注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操注：为什么要用卵细胞？
