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1、实验十七实验十七 蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法一、目的：一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。（2）学习用标准蛋白质混合液制作 Ve，Kav对 1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。二、原理：二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography） ，排阻层析法（exclusion chromatography） 。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以
2、把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图 17-1。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名 Sepharose） ，人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为 B
3、io-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为 Sephadex 型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图 17-2 所示。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积” ，以 Vt（total volume）表示。实际上 Vt是由 Vo，Vi与 Vg三部分组成，即：Vt=Vo
4、+Vi+VgVo称为“孔隙体积”或“外体积” （outer volume）又称“外水体积” ，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume） ，又称“内水体积” ，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此 VtVo等于 Vi+Vg 。它们之间的关系可用图 17-3 表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与 Vo及 Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中 Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（
5、峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=ioe VVV 上式中 Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约 200 万的蓝色葡聚糖-2000 等）通过实际测量求出；Vi可由 gWR求得（g 为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示） 。因此，对一层析柱凝胶床
6、来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积 Ve，就可算出它的 Kd值。以上关系可用图 17-4 表示。Kd可以有下列几种情况：1、当 Kd=0 时，则 Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻） ，洗脱体积等于空隙体积（图中组分） 。2、当 Kd=1 时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图中组分） 。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即 Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即 Kd都等于 1，它们既使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范
7、围。3、当 0Kd1 时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在 Vo+Vi之间变化（图中组分） 。4、有时 Kd1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时 VeVo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的 Kd1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在 Sephadex G-25 中的 Kd 值分别为 1.2，1.4 和 2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到 Kd=1 的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用 G-10 型得 Kd值 0.75 左右，用 G-25 型得 0.8 左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的
8、一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时 Vi即不能以 gWR计算，为此也常有直接用小分子物质 D2O，NaCl 等通过凝胶柱而由实验计算出 Vi值的。另一个解决的办法是不使用 Vi与 Kd，而用 Kav（有效分配系数）代替 Kd，其定义如下：已知Kd=，将 VtVo代替 Vi，则：ioe VVV Kav= otoe VVVV 即 Ve=Vo+Kav(VtVo)在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒（ViVo）作为固定相，而洗脱剂（VeVo）作为流动相。Kav与 Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相
9、流过 Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1K2logMrK1与 K2为常数，Mr为分子量，Ve也可用 VeVo（分离体积） ，Ve/Vo（相对保留体积） ，Ve/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或 Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以 Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线” ，如图 17-5 所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要
10、的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在 pH68 的范围内，线性关系比较好，但在极端 pH 时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋
11、白在含糖量超过 5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其它方法的测定相对照，由此才可作出较可靠的结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的分子量。下面实验是用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。三、试剂及器材：三、试剂及
12、器材：1 1、试剂：、试剂：（1）标准蛋白质混合液（各 23mgml-1，用氯化钾-乙酸溶液配制） ，牛血清清蛋白（Mr67000） ，鸡卵清蛋白（Mr43000） ，胰凝乳蛋白酶原 A（Mr25000）和结晶牛胰岛素（PH2 时为二聚体 Mr12000）等均需层析纯。（2）蓝色葡聚糖-2000（810mgml-1） ，N-乙酰酪氨酸乙酯（或硫酸铵或重铬酸钾）（810mgml-1） 。（3）0.025moL-1氯化钾-0.2molL-1乙酸溶液，Sephadex G75（或 G100） ，5%Ba（Ac）2。（4）待测蛋白质样品液。2 2器材：器材：层析柱：柱管（直径 1.01.3cm；管长
13、90100cm） ，核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动部分收集器，恒压瓶，下口瓶。四、操作步骤：四、操作步骤：1、一般操作方法：、一般操作方法：（1）凝胶的选择和处理凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样，流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近 100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。种类凝胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。（2）装
14、柱装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。装柱方法与一般柱层析法相似。层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品（图 17-6） 。装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约 1/3 柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约 23cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm 处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过 23 倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。新装好的柱要检验其均一性，
15、可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为 Blue dextran-2000） 、红色葡聚糖或细胞色素 C 等配成 2mg/ml 的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。（3）加样要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量：12ml/100ml 柱床容积（12%） ；制备用量：2030ml/100ml 柱床容积。加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约 50cm 处（Sephadex G-75，选用 50cm 液柱操作压） ，打
16、开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作，用 1ml 洗脱液冲洗管壁 2 次。最后加入 34ml 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图 17-7） 。（4）洗脱洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品） ，如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。本实验洗脱用 0.025molL-1氯化钾-0.2molL-1乙酸溶液。洗脱时，打开上、下进出口夹子，用 0.025molL-1氯化钾-0
