菌种鉴定方法

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1、实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作。不论鉴定对象 属哪一类，其工作步骤都离不开以下三步：分离纯化菌种；测定一系例必要的鉴定 指标；查找权威性的鉴定手册。 一、经典分类鉴定方法群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等 * 形态 个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等 * 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等 * 生理、生化反应 酶；产酶种类和反应物性等 * 代谢产物：种类，产量，显色反应等 * 经典指标 生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等 * 生活史特点 * 血清学反应 * 噬菌体的敏感性 * 其它 二、现代分类鉴定方法 * 近年来，随着分子生

2、物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作 有了飞速发展。对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学 特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次 上。 * （一）微生物遗传型的鉴定 * DNA 是除少数 RNA 病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特 有的、稳定的 DNA 成分和结构，不同微生物间 DNA 成分和结构的差异程度代表着它们间 新缘关系的远近。因此，测定每种微生物 DNA 的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要 的指标： 1. DNA 的碱基组成(G+Cmol%) * 每一个微生物种的 D

3、NA 中 GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等 的变化而变化，而且在同一个属不同种之间， DNA 中 GCmol% 的数值不会差异太大，可 以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 GC mol% 范围。 DNA 中 GC mol% 分 析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌 DNA 中 GC 含量的变化范围一般在 25 75 ；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 51%) 。一般认为任何两种微生物 在 GC 含量上的差别超过了 10 ，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用 G+C mol 来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意

4、的是，亲缘关系相近 的菌，其 G+C mol 含量相同或者近似，但 G+C mol 相同或近似的细菌，其亲缘关系 并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 51 之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不 现实的。要比较两种细菌的 DNA 碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需 做核酸杂交试验。 1. DNA 的碱基组成(G+Cmol%) * 1）每个生物种都有特定的 GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的 GC%范 围为 25-75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。 * 2）

5、GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理 性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。 * 3）使用原则：* G+C 含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系 近的生物，它们应该具有相似的 G+C 含量，若不同生物之间 G+C 含量差别大表明它们关系 远。但具有相似 G+C 含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。 1. DNA 的碱基组成(G+Cmol%) * 同一个种内的不同菌株 G+C 含量差别应在 45%以下；同属不同种的差别应低于 1015%。 所以 G+C 含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种

6、、属甚至科的 分类鉴定有重要意义。 * 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其 G+C 含量的差别大于 5%， 则肯定不是同一个种，大于 15%则肯定不是同一个属。 * 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C 含量是一项重要的，必不 可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些 G+C 含量差别大的种类排除出某一分类单元。 2.核酸的碱基组成和分子杂交： * 与形态及生理生化特性的比较不同，对 DNA 的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直 接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。 DNA-DNA 杂交 * DNA 杂交

7、法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ，然 后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同， 则它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分 相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。由此；杂合率越高， 表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠 埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，

8、 约有 70 。 G+Cmol 的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途 径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间 的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。 DNA rRNA 杂交 * 目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核 苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不同的 是 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的 部分是 rRNA 。 DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而

9、DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以作出 RNA 相 似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不 同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较 rRNA 顺反子的实 验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。 3.建立 16 S r RNA 系统发育树 * a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有

10、生物类群； * 传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载，因此多限于研究后生生物 （metazoa） ，而后者仅占整个生物进化历程的 1/5 * b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法； * c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据； * d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分类、鉴定 理论；* e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是 不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。 3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析 * 首先， 16S rRNA 普遍存在于

11、原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的 漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有 高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同 的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷 酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。 分离菌株 16S rRNA 基因 * 。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100L 无菌重蒸 H 2 O

12、 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3 ； 5-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3 。扩增 反应体积 50 m L ，反应条件为 95 预变性 5min ， 94 变性 1min ， 55 退火 1min ， 72 延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热

13、循环仪上进行。 取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术 公司完成。 比对分析 * 测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字 板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比 对分析 ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST blastn 选项，将测序所得序列粘贴

14、在“ search ”网页 空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出 相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。 比对分析 * 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本 间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起 输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输 入 P

15、hylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各 分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠 换赋于相同的加权值。 （二）细胞化学成分的鉴定 * 除上述核酸成分外的其它化学成分的测定，是微生物化学分类法的重要内容，主要包括： 1.细胞壁的化学成分。2.全细胞水解液的糖型。3.磷酸类脂成分的分析。4.枝菌酸的分析。5. 醌类的分析。6.气相色谱技术的应用。 （二）细胞化学成分的鉴定 * 微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类 法 (chemot

16、axonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成， 已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表 细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用 细胞化学成分鉴定的意义 * 随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细 胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古 菌的标准之一，细菌具有酰基脂 ( 脂键 ) ，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用 以区分古菌。霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘 氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一 个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析 对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。 （三）数值分类法 * 数