慢病毒载体的构建慢病毒载体的构建一．构建原理： 慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除 gag、po l 和 env 这 3 个和单纯逆转 录病毒相似的结构基因外, 还包括 4 个辅助基因, vif、vp r、 nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 revH IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为 基础进行构建的慢病毒载体的构建原理就是将 H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装 信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离载体系统包括包装成分和 载体成分: 包装成分由 H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而 构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录 和整合所需的 H IV 21 顺式作用序列同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位 点插入的目的基因为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将 包装成分的 5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成 SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达 gag 和 po l、另一个表达 env二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染 HEK293THEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水 ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程: 1. 铺细胞: 选择状态良好的 293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish. 2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约 50-70%的时候,进行转染.下面就 35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如 0.5ug/ul, 即用 4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往 eppendorf 管中依次加入上述四种试剂. 先将前三者混匀, 最后加 2XHBS.一种方法是,加 2XHBS2XHBS 时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h 后换液.另一种方法是, 加入 2XHBS 后立即吹打约 40 下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h 后换液.二）转染方法 2-Fugene 转染病毒包装 1．传 293T 细胞，将 T75 用明胶包被，每瓶 T75 加 1.5-2mL 明胶，置于 37 度培养箱 10min。
即可使用，铺细胞前，将明胶再次将瓶底完全覆盖一次，完全吸净，即可将细胞铺上传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺 900-1000 万/T75；若第三天转染，铺 350-400 万/T75每瓶 T75 加 10mL 10％DMEM 培养基1.1 传 293T 细胞将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 4 度冰箱取出的 0.25%0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪用 10mL10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 1010 倍稀释，混匀，取 10ul10ul细胞于计数板中计数计数板上共 4 大格，每大格 16 小格计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
2．转染当天观察细胞密度，80-9080-90％满即可进行转染转染前无需换培养基3．做脂转 complex：Opti MEM 需在 37 度水浴中预热，FugeneFugene 转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀转染每瓶 T75 的 complex 成分如下：含 cDNA 的 lv 质粒：10ugpVSVG：5ugdelta 8.91：7.5ugopti MEM 补足至 1mL 后，用 1mL 枪混匀，正常吹打 5-6 次，加入 56ul Fugene 转染试剂，加至 optiopti MEMMEM 液面之下，吹打 3-43-4 次再用 1mL 枪混匀，正常吹打 5-6 次，室温放置15min，即可加入 T75 瓶中晃匀后，隔 2-4h2-4h 后再晃匀一次即可4．转染后 12-24h，将 T75 瓶中的培养基弃去，加入 10％ DMEM 10mL，即开始收集病毒5．收集 24-48h 病毒上清，收集后置于 4 度冰箱保存三）感染方法-病毒滴度测定(感染同此法)5.1 此时即可用病毒上清测病毒滴度（悬浮感染）：①. 在 24 孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被 24 孔板 10min 以上（同步骤 1，每孔加入200ul 明胶，移液管两滴左右）。
②. 消化 293T 细胞（步骤 1.1），24 孔板每孔 15 万细胞可将细胞做 mix，体积扩大到15 万细胞/500ul，加入 1/1000 polybrene，混匀，每孔加入 500ul 15 万细胞即可③. 将病毒上清 4000rpm 离心 5min，将细胞碎片离至管底取 5ul 病毒上清至上述步骤中传入 15 万每孔的 24 孔板一孔中，摇匀；48h 后即可在荧光显微镜下观察其滴度5.2 病毒滴度确定：①. 15 万 293T 细胞 48h 即可刚好长至 90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于 293T 细胞易飘，固定及 DAPI染色整个过程请务必保持 293T 细胞处于液面之下用 PBS 涮 3 次加入 4％ PFA 室温固定30min, 24 孔板每孔 200ul③．用 PBT 洗 2 次，每次 3 分钟④．PBS 将 DAPI 1000 倍稀释，每孔加入 200ul，避光室温静置 5min⑤．PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，即可在荧光显微镜下计数，取 2-3 处取平均值⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷5×1.5×105×103。