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1、 江南江南大学大学全全日日制制硕硕士士研研究究生生课课程程论论文文脂肪氧合酶的研究及应用浅述脂肪氧合酶的研究及应用浅述Research and Application of lipoxygenase Brief Introduction学生姓名学生姓名：伍伍 悦悦学学 号：号：61301120816130112081年级专业：年级专业：20200 01 13 3级食品科学与工程级食品科学与工程学学 院：院：食品学院食品学院江苏无锡提交日期：2013 年脂肪氧合酶的研究及应用浅述脂肪氧合酶的研究及应用浅述学生：伍悦学号：6130112081江南大学摘要：脂肪氧合酶是绿色食品添加剂的研究热点。本文
2、介绍了脂肪氧合酶发现历史，结构性质，催化机制，应用及其研究现状，分离提取的方法，并展望了今后的研究方向。关键词：脂肪氧合酶；结构；分离提取；催化机制；应用；研究现状Research and Application of lipoxygenase Brief IntroductionStudent:Wu YueStudent ID：6130112081Abstract: Lipoxygenase is a hot green food additives.This article describes the history of lipoxygenase found,separation and
3、 extraction methods,structural properties,catalytic mechanism, application and research status and prospects of future research directions.Key words: Lipoxygenase; structure; separation and extraction; catalytic mechanism; application; research status 前言脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)又称脂肪氧化酶,属于氧化还原酶属。它广泛地分布
4、于各种植物中，在豆类中具有较高的活力，其中在大豆中的活力最高。脂肪氧合酶结构中含非血红素铁，能专一催化具有顺，顺4-烯结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物。亦催化酯的氢过氧化作用，生成的氢过氧化物具有高度的反应能力，它能作用于食品中各种不同的组分。最普通的天然底物是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。脂肪氧合酶对食品质量有多重影响，它既有利于提高一些指标，又能损害一些质量指标。故对脂肪氧合酶深入研究对现代食品、工业、发酵等行业的发展具有重要意义。1 脂肪氧合酶的发现历史脂肪氧合酶广泛存在于豆科类植物的种子中。其中以大豆，绿豆及豌豆中的活性较高。大豆中蛋白含量为40%左
5、右，成熟的种子中，脂肪氧合酶占总蛋白含量的12%。大豆中的脂肪氧合酶活性高于其他植物中提取的脂肪氧合酶，从大豆中提取脂肪氧合酶的效率较高。故大多数的研究都以大豆脂肪氧合酶为模型而进行的。1932年A ndre和Hou 首先发现大豆蛋白制品产生豆腥味是因为其中多元不饱和脂肪酸发生酶促反应的结果，其中关键的酶就是脂肪氧合酶。1947 年Theorell 等首次从大豆中提取了脂肪氧合酶结晶，相对分子质量为10.2万。在随后的25 年里，关于脂肪氧合酶的研究进展非常缓慢。1953年Franke和Freshe在首次研究了大麦中的LOX。1963年Tappel等发现动物组织中也存在催化不饱和脂肪酸氧化的L
6、OXs，若处理不当，其会对产品风昧、色泽及储藏稳定性造成严重不良影响。随后，研究发现人体和牛科动物血小板中也存在LOXs，能氧化花生四烯酸(AA)生成12-过氧化氢衍生物。自1972 年Chan在国际会议上宣布每摩尔大豆脂肪氧合酶(LOX-1)含有1ml铁后，有关脂肪氧合酶的研究迅速升温，大多数脂肪氧合酶信息主要来自对大豆脂肪氧合酶同工酶研究。1972年Christoper等又报道了大豆中脂肪氧合酶一2、脂肪氧合酶一3的存在。1982年Ramadoss等运用Synchropak Ax一30离子交换柱对大豆粗提物进行高性能液体层析分离，结果显示大豆存在4种不同脂氧合酶活性。到目前为止发现脂肪氧合
7、酶的许多同工酶，可采用电泳的方法将它们分开。从大豆种子中分离出脂肪氧合酶的三种同工酶，即 LOX-1、LOX-2、LOX-3。在幼苗中还有其他三种同工酶 LOX-4、LOX-5、LOX-6。在受伤后不久的大豆叶片中也已分离出 LOX-7、LOX-8 两种同工酶，并发现这两种同功酶在幼叶、花和未成熟的荚中都存在，并具有很高的酶活性。这些同工酶的分子结构上的差别目前还不是很清楚，但它们最适PH对值，酶的专一性，等电点，热稳定性，底物特异性，对色素漂白能力，LOOH的分解产物和Ca+对其作用等很多生化特性确实有所不同。大豆的LOX-1 和LOX-3的晶体结构已经被鉴定。研究者从水稻成熟种胚中也分离出
8、了三种LOX 同工酶，根据层析图谱洗脱顺序的不同，分别定名为水稻 LOX-1、LOX-2 和 LOX-3,其中 LOX-1 和LOX-2 属于第 类 LOX，即13-LOX，而 LOX-3 属于第类 LOX 即 9-LOX。另外在藻类、面包酵母、真菌以及氰细菌均发现有LOX 的存在。从豌豆，青刀豆，蚕豆和小麦等中都分离出脂肪氧合酶的同工酶。利用简单的亲和色谱可将同工酶进行分离和鉴定。已经利用多不饱和脂肪酸的氨基己衍生物成功的分离出LOX-1同工酶，且不饱和程度越高，分离的专一性和灵敏度越高。同时由于层析方法的改进又将LOX-3分离成LOX-3a和LOX-3b。根据报道，在成熟大豆种子中，以蛋白
9、质为基准，同工酶LOX-3含量最高，LOX-1的含量与LOX-3几乎相同，LOX-2含量最少。若以酶活性为基准，LOX-2活性最高，所以在大豆中他们活性很接近。近年来，由于分子生物学及分子遗传学等学科的飞速发展，大家开始利用基因沉默、基因删除等手段进行转基因植物的研究，同时结合先进的化学检测方法对LOX产物进行分析，大大推动了LOX途径及代谢产物生理作用的研究。但是，由于LOX是一个多基因家族，存在同工酶，使得各种LOX具体的生理作用、作用机理及在信号途径中扮演的角色等研究仍然存在着很多困难。2 脂肪氧合酶的结构脂肪氧合酶(Lipoxygenase,LOX, EC1.13.11.12)一种单一
10、多肽链蛋白质，分子量高达103KDa，其结构中含非血红素铁，能专一催化具有顺，顺-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物。借助电子顺磁共振(EPR )、X 射线衍射(XRD )、红外(IR )、圆二色(CD )、磁性圆二色(MCD ) 等技术, 人们对脂肪氧合酶的结构有了深人的了解。1987年，研究者利用分子克隆技术首次确定了大豆脂肪氧合酶(LOX一l) 的完整的氨基酸序列。1993 年脂肪氧合酶的XRD结构及其催化位点的结构首次被报道。现在已经研究出了3种脂肪氧合酶的晶体结构，包括2种大豆脂肪氧合酶同工酶和1种鼠网织红细胞中的脂肪氧合酶。通过X-射线
11、衍射确定大豆LOX-1三维空间结构，包括两个区域：较小的氨基末端区域，是由146个残基组成-折叠；较大的羟基末端区域，有酶的活性位点和-螺旋二级结构693个残基组成。植物脂肪氧合酶的氨基酸残基比动物脂肪氧合酶多25 %，但它们的氨基酸序列在某些区域内有很大的相关性，初期催化反应的机理基本相同脂肪氧合酶分子中含金属原子非血红素铁，运用物理方法研究该金属原子的性质和环境，发现其处于一种八面体配位环境。在一定条件下，铁原子从高自旋的Fe ( )静态转变为具有催化活性的高自旋的Fe( )态。同时，脂肪氧合酶可以被它催化生成的氢过氧化物激活。通过确定大豆脂肪氧合酶(LO X -1 、LO X -2 )
12、的初级结构，可以观察到1个富含组氨酸(His )残基的区域。进一步的研究表明His499、His504 和His690(LOX一l) 对键合铁原子很重要。铁原子中心活性位点包括5个内源配体和1个空余的外源配体对大豆LOX一1 、L OX一3 来说，内源配位体由3个His 残基(His499 、His504 、His690 )1个Ile839 残基末端碳原子上的梭基以及1个配位距离较一般配位键稍长的Asn694残基上的占一氧原子组成。第6个配位点也许是被水分子配体占据，此位点是催化机制的关键。尽管对脂肪氧合酶结构研究积累了大量信息，但对其结构和功能关系仍不是很清楚。脂肪氧合酶活性部位的结构也尚不
13、完全清楚。3 催化机制3.1 催化反应特征3.1.1 底物特异性LOX 对作用底物具有结构特异性的要求，含有顺, 顺-1，4-戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇都可以作为LOX 的底物。这样就决定了可作为脂肪氧合酸底物的物质种类比较少，在植物中其天然底物主要是亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)，在动物体内其天然底物主要是花生四烯酸(20:4)，它们均属于必需脂肪酸。另外，在不饱和脂肪酸中，顺, 顺-1，4-戊二烯的位置对脂肪氧合酸的作用有显著影响。除了天然的脂肪酸底物外，其它的天然底物还有脂肪酸的甘油酯和磷酸甘油酯，但他们与多不饱和脂肪酸比反应活力有所降低。近年来，已经发现一个烯醇的双键被羰
14、基的双键代替的底物，结构像酮或半缩醛一般。已合成出很多非天然的底物用于酶学机理的研究，它们的结构不同于那些普通的脂肪酸。LOX 来源不同，底物不同，都会导致其加氧的位置不同，因而产物也不同。LOX-1 的底物为不饱和脂肪酸，产物为13-氢过氧化物，LOX-2 的底物为酯化底物，产物为9-或13-氢过氧化合物。大豆的三种同工酶的底物特异性也不尽相同。3.1.1 温度和PH不同来源的LOX最适PH值和最适温度均不同。Yabuuehi和Tappel等报道大豆的三种脂肪氧合酶（ LOX-1、LOX-2、LOX-3）的最适PH值不同，LOX-2、LOX-3为67，而LOX-1的最适PH值为9。LOX-2
15、和LOX-3在68时迅速失活，而LOX-1至少需要2min才能失活，LOX-3在60时需要1530min失活，LOX-2在5min内失活。3.2 催化反应及机理3.2.1 自由基学说脂肪氧合酶的反应机理是铁催化单电子氧化还原反应，导致多不饱和脂肪酸产生自由基。在催化反应机制上，1952年Tappel 等认为，LOX 所催化氧化的亚油酸不同于亚油酸自动氧化过程。首先是亚油酸氧合 LOX 形成复合体。再在酶的表面形成一个双游离基活化体，即一个氢离子和一个电子从亚油酸上转移至氧分子上。双游离基在酶分子表面结合形成亚油酸过氧化氢。此过氧化氢物与酶分离并脱落下来。如图一所示，自由基理论认为：首先氢原子从
16、底物上离开，同时铁离子被还原。2003年Tomasz等通过混合密度功能理论的研究证明了氢原子的这一转移过程，同时发现这一步是最困难的一步，所需要的活化能为12.1kcal/mol ,反应焓为126kcal /mol。1994年Scarrow等认为转移的氢是被LOX活性部位的铁离子相连的羟基组份接受。然后分子氧与底物自由基反应，形成过氧化自由基，在此过程中有可能伴随O2 转变成 O2自由基， 最后过氧自由基被 LOX 中的铁还原，生成氢过氧化合物，而LOX中的铁转变为 Fe3+，重新转变为活性态。3.2.1 过氧化物机制脂肪氧合酶过氧化催化机制已提出了不少假设，在这些假设中，包括两种不同途径：好氧反应和厌氧反应，这两种反应可能同时发生。首先激活天然酶，从活化亚甲基中移去一个氢原子，再将氧接入底物分子中产生氢过氧化物。1997年Prigge等研究脂肪氧合酶活性发现每分子脂肪氧合酶都含有一个非血红素铁原子,在大豆脂肪氧合酶中这个铁是高自旋的, 常以两种氧化态: Fe 2+ 非活性形
