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1、项目名称： 人类重要病原体致病机制研究人类重要病原体致病机制研究首席科学家： 金奇金奇 中国疾病预防控制中心病毒病预中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所防控制所起止年限：依托部门： 卫生部卫生部一、研究内容本课题研究围绕病原体变异及变异与致病性的关系这个传染病基础研究中的核心科学问题，分别针对乙型肝炎病毒、艾滋病毒和肠道病原菌的生物学及致病特点开展相关研究。一一、乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒遗遗传传学学特特征征及及其其致致病病和和致致癌癌相相关关性性研研究究本项目主要研究内容包括：（ 1）分析我国 HBV 基因型及重组体的分布特点以及与疾病谱和抗病毒治疗应答的关系；（ 2）研究 HBV 蛋白和细胞
2、因子相互作用的生物学功能，探讨 HBV 感染、致病和致癌机理；（ 3）研究抗原特异性免疫在乙肝发病与转归中的作用及其网络调控机制。1分析我国 HBV 基因型及重组体的分布特点以及与临床疾病谱和抗病毒治疗应答的关系（1）HBV 遗传变异及其分子流行病学研究（2）病毒因素、宿主因素、核苷类似物抗病毒治疗应答相关性研究主要包括：不同 HBV 基因型肝组织病变的特点，HBV 基因型与临床疾病谱和 HBeAg 血清学转换的关系，基因型与抗病毒治疗应答的关系；比较研究纯种 C 和 D 基因型以及我们鉴定的 D/C 重组体三种毒株的临床分子病毒学特点；将重组体的重组区域与纯种基因型原位置换，应用转染细胞系研
3、究 D/C 重组体与纯种 C 和 D 基因型对病毒复制和抗原表达的影响；同时共转染遗传背景不同的细胞系，研究有无毒株选择优势；在系统分析不同基因型和重组体基因组学特点的基础上，优化和改进现有 HBV 基因分型方法，提出新的基因分型体系。2 研究 HBV 蛋白和细胞蛋白相互作用的生物学功能，探讨 HBV 感染、致病和致瘤的分子机理（1）建立以杆状病毒为载体的 HBV 感染新技术平台，筛选与 HBV 感染相关的细胞因子及其功能性研究（2）研究与 HBV 病毒复制、转录、病毒颗粒装配相关的基因在 HBV 病毒生活周期中的功能（3）探索 HBV 感染的受体和辅助受体（4）分离、鉴定与 HBx 蛋白相互
4、作用的新细胞蛋白（5）与 HBx 相互作用蛋白因子的表达差异研究（6）超表达 HBx 蛋白及其相互作用细胞蛋白对细胞生理功能的和 HBV 病毒的影响（7）抑制与 HBx 蛋白相互作用蛋白表达后对细胞生理活性和 HBV 病毒的影响（8）在实验动物水平 HBx 蛋白及其相互作用蛋白的功能性研究利用 Bac-to-Bac 杆状病毒真核表达系统，构建含有完整 HBV 基因组的重组杆状病毒。利用该重组病毒感染不同肝细胞，选择一个或几个合适的细胞系作为研究 HBV 的分子生物学和药物的筛选的平台。利用杆状病毒能转导不同的肝细胞的特性，利用 Microarray 分析重组 HBV 感染前后细胞的转录谱，结合
5、差减文库来筛选与 HBV 感染相关的基因。采用蛋白质二维电泳、质谱，结合蛋白质组学和噬菌体展示文库，最新的组织表达蛋白或者 DNA 芯片等现代生物学技术分离并鉴定 HBV 感染相关的受体和辅助受体。采用酵母双杂交系统筛选和差异表达文库分析等方法，寻找与 HBx 蛋白相互作用的细胞蛋白，研究 HBx 蛋白与其相互作用细胞蛋白对细胞凋亡、细胞转化、增殖等生物学功能。在细胞和组织水平上分析 HBx 蛋白相互作用细胞因子的表达差异，研究新的相互作用细胞因子的生物学功能。HBx 蛋白与激活的ras、Myc 等肿瘤因子相互作用对细胞转化以及试验动物致瘤性的影响，并借助现代分子生物学、细胞生物学、分子病毒学
6、技术阐明 HBx 蛋白及其相互作用的细胞蛋白对细胞凋亡、生长特性等的影响作用途径，深入探讨 HBV 致病和致癌的分子机制。3研究抗原特异性免疫调节 T 细胞在病毒性肝炎发病与转归中的作用及其网络调控机制（1）中国旱獭嗜肝病毒急、慢性感染模型的建立（2）中国旱獭嗜肝病毒模型在 HBV 感染相关疾病研究中的实际应用（3）利用小鼠模型研究特异性 Tr 细胞包括 DN Tr 在调节机体产生适度的免疫反应以清除肝炎病毒、抵抗感染中的作用和作用机制（4）CD4 或 CD8 淋巴细胞耗尽后对 MHV-3 所致重症肝炎炎性反应的影响（5）特异性 Tr 包括 DN Tr 的 MHV-3 抗原特异性免疫保护作用和
7、机制（6）研究特异性 Tr 细胞包括 DN Tr 在乙型肝炎发病中的作用、机制及应用（7）特异性 Tr 和 DN Tr 的 HBV 抗原特异性免疫保护作用和机制拟建立旱獭嗜肝病毒动物模型，不仅价格便宜且容易获得，适合在中国推广使用，而且该动物模型是建立在国际认可的土拨鼠模型的基础上，能得到国际同行的认可和接受。因此这种适合中国国情的经济适用的嗜肝病毒动物模型的建立，不仅将为研究 HBV 感染的发病机制和筛选合适的抗病毒药物和治疗性疫苗提供很好的技术平台和研究工具，而且将大幅度提高我国在 HBV 感染相关疾病研究上的整体水平。本部分还将进行下述研究：利用小鼠模型研究特异性 Tr 细胞包括 DN
8、Tr在调节机体产生适度的免疫反应以清除肝炎病毒、抵抗感染中的作用和作用机制。不同种系小鼠 MHV-3 感染前后 T 细胞亚群的动态观察，CD4 或 CD8 淋巴细胞耗尽后对 MHV-3 所致重症肝炎炎性反应的影响，特异性 Tr 包括 DN Tr 的MHV-3 抗原特异性免疫保护作用和机。研究特异性 Tr 细胞包括 DN Tr 在调节机体产生适度的免疫反应以清除 HBV、抵抗感染中的作用和作用机制。不同临床类型乙型肝炎患者 T 细胞亚群的观察，特异性 Tr 和 DN Tr 的 HBV 抗原特异性免疫保护作用和机制。二、乙型肝炎病毒变异及与宿主相互作用的分子与免疫机制二、乙型肝炎病毒变异及与宿主相
9、互作用的分子与免疫机制1、预防疫苗无应答、治疗性疫苗免疫效果和 HBV 免疫损伤的机理研究。对不同临床类型、病毒学指标、病理背景的 HBV 感染病例及对预防疫苗无应答的人群进行细胞免疫状况的分析，明确 CTL、DC、Th 细胞等以及不同亚群之间的关系，以阐述细胞免疫与临床表现、病毒学指标、免疫应答和免疫病理之间的关系。2、HBV 持续表达大量 HBsAg 的细胞学基础、其作用机制及其导致的效应将采用持续表达 HBsAg 的转基因鼠及稳定表达 HBsAg 的细胞系。整体思路是从细胞微生物学的角度,研究 HBV S 基因持续表达 HBsAg 对宿主细胞功能及细胞蛋白的影响及作用。所用的技术涉及转录
10、体组学和蛋白质组学，因此本研究也可看作是对 HBV 感染的系统生物学研究的一个切入点。3、控制 HBV 复制能力的细胞蛋白及 HBV 拮抗干扰素机理的研究。拟利用乙型肝炎体外病毒复制细胞系统和肝炎患者，在乙肝病毒感染和或干扰素作用下，比较两者间的基因组和蛋白组的背景差异，鉴定或发现表达水平差异显著的已知或未知蛋白，并对高度差异的基因及其表达产物通过RNAi、细胞融合、组织病理学等加以明确，以研究乙型肝炎病毒与干扰素在宿主细胞内的相互作用，并进一步探索其分子机制，一方面研究干扰素诱导的细胞基因在抗病毒及信号传导途径中的作用；另一方面研究乙肝病毒在细胞内基因复制和蛋白表达对干扰素合成,调节信号通路
11、和效应蛋白的影响。三、艾滋病毒变异与流行和致病及免疫机制的研究三、艾滋病毒变异与流行和致病及免疫机制的研究HIV 对宿主的感染是完整而有序的连贯过程，涉及宿主的信号系统、膜系统和细胞骨架系统。HIV 的变异及重组是影响病毒的流行和致病性的主要因素，而机体的免疫反应在宿主抗病毒防御中起决定性作用，结合 HIV 与宿主细胞及超感染病毒间相互作用的研究，发现新的预防和治疗策略以及靶位点，为控制艾滋病提供新的思路。针对上述特点，本课题待解决的主要科学问题包括：1、艾滋病毒的变异规律及其意义。包括不同病程时期重组艾滋病病毒各基因区的变异特征、规律及其与病毒复制能力、疾病病程及转归之间的关系。2、免疫反应
12、在抗 HIV 感染防御体系中的作用。包括 IgA 在抗 HIV 粘膜相关特异免疫中的作用，IgA、CTL、中和抗体以及排斥免疫参与抗 HIV 粘膜防御的机制，CTL、T 细胞表位及中和表位与病毒逃逸的关系，HIV 侵入后急性感染阶段参与控制病毒早期复制的免疫细胞类型，以及粘膜上皮细胞、树突状细胞和淋巴细胞在 HIV-1 粘膜传播和抗 HIV-1 粘膜免疫形成中的作用等。3、病毒与宿主相互作用对 HIV 致病性的影响。包括疱疹病毒和 HIV 相互作用的过程及疱疹病毒超感染对 HIV 的影响，HIV 内吞出芽与细胞内吞途径间的相互关系，HIV 侵入过程中膜蛋白的构象变化及内吞和出芽的分子机制等。针
13、对上述问题，拟开展以下 3 方面研究：1、HIV 变异及与致病性关系的研究分别以新发感染队列人群、长期不进展者与慢性感染队列人群为目标人群，观察病毒在感染早期与慢性期其 Tat、LTR、env 和 gag 基因区的变异率，探讨我国 CRF07_BC 重组艾滋病毒在感染早中期基因特征和年度变异频率，分析病毒基因变异规律；在上述不同队列中连续观察并分离不同病程时期的我国重组HIV 病毒株，从生物学、分子病毒学和流行病学等层面研究我国重组 HIV 毒株的细胞嗜性（M/T 嗜性） 、致细胞病变性（SI/NSI） 、复制动力学和辅助受体的使用情况；确定其保守的 V3 环在重组病毒不发生 NSI 到 SI
14、 转换所起的作用，并阐明其机制；通过检测不同变异 tat 和 LTR 感染性克隆复制水平的高低，阐明重组病毒感染者病毒载量明显偏低的机制及其不同变异 tat 和 LTR 基因在其中所起的作用和相互作用机制；揭示该重组毒株拷贝低、病程长和发病晚的原因；根据上述研究结果结合分子流行病学研究，分析该重组病毒在我国迅速流行的病毒学原因。2、抗 HIV 的免疫反应影响 HIV 致病性的研究。在已建立的新发感染、慢性感染和长期不进展者队列中观察 T 细胞免疫反应并测定在疾病不同时期 HIV 特异性 T 细胞的数量与功能变化，同种异体排斥T 细胞反应在保护机体免于 HIV 感染中所起的作用，体液免疫尤其是中
15、和抗体在保护性免疫中所起的作用；在阐明免疫保护机制的基础上探索病毒逃逸的机制以及逃逸病毒在疾病进展与病毒传播中所起的角色。获得抗 HIV 不同组分包括 gp120, gp41, pol, gag 等的 IgA 单克隆抗体，测定其在细胞内外的抗病毒效应，以及与粘膜相关的抗病毒功能；利用粘膜上皮细胞模型测定 HIV 蛋白特异性的 IgG 和 IgA 单克隆抗体抗 HIV 病毒的多重效应；了解 HIV 蛋白特异性的IgG 和 IgA 单克隆抗体与粘膜间的相互作用及在粘膜防御中的功能特征。确定中国 HIV-1 B与 HIV-1 C 亚型毒株全长感染性克隆和单复制周期侵染性克隆的遗传、生化及其免疫学特性
16、，为本项目其它问题的研究提供有效工具；研究被 SHIV-B与 SHIV-C 感染的免疫细胞功能缺失；利用体外细胞培养模型和猴个体间自然传播动物模型研究病毒粘膜传播早期上皮细胞、树突状细胞与淋巴细胞的作用。3、病毒/宿主相互作用及病毒超感染影响 HIV 致病性的研究。利用疱疹病毒与 HIV 超感染模型，借助蛋白之间相互作用分析、RNA 干扰和蛋白激酶分析等手段，阐明对 HIV LTR 启动子活性影响最大的 NF-B 通路和 AP-1 通路，建立系统完整的作用模型；利用疱疹病毒立即早期基因产物具有泛素连接酶 E3 活性的特点，将它们作用于来自宿主或超感染病毒的特定调节因子，研究这些产物对 HIV 基因表达的影响；研究 HIV Tat 和宿主蛋白间的相互作用，并对 COX-2 等 Tat 相关蛋白的致病机理进行研究；分析 HIV-1 囊膜蛋白 gp41 介导膜融合的过程，通过定点突变改变 gp41 的功能区域，构建 HIV-1 融合中间状态的突变体，并解析这些突变体的结构，研究囊膜蛋白在与细胞融合阶段的分子结构和构象变化过程；通过药物、诱变和抗体特异阻断不同的内
