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1、基因工程课程实验指导书生物技术专业生物技术专业黄淑坚黄淑坚 黄良宗黄良宗 编写编写佛山科学技术学院佛山科学技术学院 20052005 年年 1212 月月I目目 录录前 言.实验一 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）.1实验二 DNA 目的片段的回收与 DNA 的体外连接.7实验三 重组 DNA 的转化 .10实验四 重组 DNA 的鉴定 .13实验五 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达.16实验六 表达产物的检测与分析SDS-PAGE.18附录 .22参考文献.34II前前 言言基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自 DNA 重组技术于 19
2、72 年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。编者2005 年 12 月1实验一实验一 反转录聚合酶链式反应（反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）一、目的和要求一、目的和要求
3、了解反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握 RT-PCR 反应的基本技术。二、实验内容二、实验内容RT-PCR 扩增猪流感病毒 M2 基因部分片段。三、仪器、设备和实验准备三、仪器、设备和实验准备1、仪器恒温水浴槽、移液枪、EP 管、PCR 管、超净工作台、PCR 仪、电泳仪。2、试剂反转录酶、RNA 酶抑制剂（RNase Inhibitor） 、流感病毒 RNA、随机引物、流感病毒 M2 基因 PCR 引物、dNTP、Taq 酶。3、实验准备用 RNA 抽提试剂盒抽提猪流感病毒 RNA。四、实验原理四、实验原理RT-PCR 是将 RNA 模板的反转录（RT）和 cDNA
4、 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR 技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选 cDNA 文库而能直接克隆 cDNA 产物。反转录反应是在反转录酶作用下，以 RNA 为模板指导合成互补的 DNA 链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或 RNA 的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链 DNA片段在 94下解链; (2) 退火(Anneal):两
5、种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在 Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下,以目的 DNA 为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。2（一）PCR 反应中的主要成份：1.1. 引物：引物：PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是 PCR 成败的关键。引物设计和选择目的 DNA 序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为 16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中 G+C 含量通常为40%-60%,可按下
6、式粗略估计引物的解链温度 Tm4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基应随机分布，在 3端不存在连续 3 个 G 或 C,因这样易导致错误引发。(4) 引物 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在 3端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在 3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在 4 个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物 5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在 5
7、端限制酶位点外再加 1-2 个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 一般 PCR 反应中的引物终浓度为 0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在 1cm 光程比色杯中,260nm 下,引物浓度可按下式计算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中 4 种不同碱基个数。 2. 4 4 种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸(
8、dNTP)(dNTP)：dNTP 应用 NaOH 将 pH 调至 7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP 原液可配成 5-10mmol/L 并分装,-20贮存。一般反应中每种 dNTP 的终浓度为 20-200mol/L。理论上 4 种 dNTP 各20mol/L,足以在 100l 反应中合成 2.6g 的 DNA。当 dNTP 终浓度大于50mmol/L 时可抑制 Taq DNA 聚合酶的活性。4 种 dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种 dNTP 的不足出现的错误掺入。 3.3. Mg2+Mg2+：Mg2+浓度对 Taq DNA 聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,
9、影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常 Mg2+ 浓度范围为 0.5-2mmol/L.对于一种新的 PCR 反应,可以用 0.1-5mmol/L3的递增浓度的 Mg2+ 进行预备实验,选出最适的 Mg2+浓度。在 PCR 反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或 EDTA 等可能影响 Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适 Mg2+ 浓度。4.4. 模板：模板：PCR 反应必须以 DNA 为模板进行扩增, 模板 DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板 DNA
10、 而言,影响 PCR 的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为 102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要 0.1g 的人基因组 DNA,10ng 的酵母 DNA,1ng 的大肠杆菌 DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的 PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的 DNA 中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA 中的杂质也会影响 PCR 的效率。5.5. TaqTaq DNADNA 聚合酶：聚合酶：在 100l PCR 反应中,1.5-2 单位的 Taq DNA 聚合酶就足以进行 30 轮循环。所用的酶量可根据 DNA、引物及其它因素的变
11、化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活 Taq DNA 聚合酶, 灭活 Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L 的 EDTA 螯合 Mg2+ 。 (3) 99-100加热 10min。目前已有直接纯化PCR 产物的试剂盒可用。6.6. 反应缓冲液：反应缓冲液：反应缓冲液一般含 10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl 和适当浓度的 Mg2+ . TrisCl 在 20时 pH 为8.3
12、-8.8,但在实际 PCR 反应中,pH 为 6.8-7.8. 50mmol/L 的 KCl 有利于引物的退火。另外,反应液可加入 5mmol/L 的二硫苏糖醇(DDT)或 100g/ml 的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入 T4 噬菌体的基因 32 蛋白则对扩增较长的 DNA 片段有利，各种 Taq DNA 聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。（二）PCR 反应参数1.1. 变性：变性：在第一轮循环前,在 94下变性 5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入 Taq DNA 聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性
13、配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使 PCR 失败,因为未变性完全的 DNA 双链会很快复性,减少 DNA 产量。4一般变性温度与时间为 94 1min。在变性温度下,双链 DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含 GC 的序列,可适当提高变性温度，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2.2. 退火：退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度，实际使用的退火温度比扩增引物的 Tm 值约低 5。一般当引物中 GC 含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温
14、度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用 94和 60)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为 37-60,1-2min。3.3. 延伸：延伸：延伸反应通常为 72,接近于 Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为 Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从 20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中,Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成 1kb 长的 DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(7-10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 4.4. 循环次数：循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于 DNA 浓度。一般而言 25-30 轮循
