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1、细胞培养技术与方法课程论文 学 院 家蚕基因组生物学国家重点实验室专 业 微生物学 级 别 2014级 姓 名 陈婷婷 学 号 112014408002214 类 别 全日制硕士 主讲教师 潘敏惠 2015年7月动物细胞培养技术与应用（姓名：陈婷婷 学号：112014408002214院系：家蚕基因组生物学国家重点实验室）摘 要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。关键词：细胞培养；应用；研究进展细胞是构成机
2、体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生
3、物、医学研究及应用广泛采用的技术方法1。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20世纪60年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法2。1 细胞培养技术细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不
4、同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906年，Harrison用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20世纪50年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域 3 。目前，在
5、细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。动物细胞虽可像
6、微生物细胞一样, 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比, 有显著差别 :动物细胞比微生物细胞大得多, 无细胞壁, 机械强度低, 对剪切力敏感, 适应环境能力差; 倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染, 培养时须用抗生素; 培养过程需氧量少培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; 培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡; 代谢产物具有生物活性, 生产成本高, 但附加值也高。微生物和动物细胞培养的差别微生物（细菌）动物细胞细胞直径（m）11010100营养谱比较广泛的基质要求严格倍增时间（h）0.521260pH控制0.50.05温度控制（）10.25
7、1.1细胞培养所需的条件：（1）培养液 以往多用天然培养液，现多用合成培养液。合成培养液有多种，如Eagle氏液、RPMI-1640、MEM和199等，各有其特点和适用范围。Eagle液主要成分为13种必需氨基酸、8种维生素、糖和无机盐等成分RPMI-1640、199乳汉液还含有其它氨基酸。不同培养液适用于不同细胞，乳汉液多用于鸡胚成纤维细胞培养；Eagle液主要适用于各种二倍体细胞，是最常用的细胞培养液，RPMI-1640、MEM液主要用于传代细胞的培养。可根据培养细胞的特殊要求进行添加：抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50100单位）和链霉素（每毫升培养液50100微克）。有机补充物，如
8、丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。（2）血清 在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。血清中的。-球蛋白和白蛋白能促进细胞生长，刺激细胞的生长活力；白蛋白具有解除脂肪酸、胰酶及金属离子等的毒性作用。此外，血清中的一些滤过物质乃是刺激和促进细胞生长的重要因子。不同动物种血清的作用差别很大，即使同一种动物种的不同个体间的差异也很显著。最好尽可能不加入血清以维持细胞活力，并避免血清对病毒增殖的抑制作用。目前国内外
9、正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。无血清培养液由基础培养液和血清替代因子组成。常用的基础液为MEM、199、DMEM、F12、RPMI-1640、DMEM+F12（1：1，称SFFD）和RPMI-1640+DMEM+F12（2：1：1，称RDE等。血清替代因子有激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、聚赖氨酸）和微量元素（如硒）4类几十种，其中有些是主要而且必需的，有些为辅助作用因子。多数无血清培养液须补加38种血清替代因子。（3）细胞接种量在适宜的培养条件下，需要有一定量活细胞才能生长繁殖，这是因为细胞在生长
10、过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，作用也小。此外，细胞接种量和形成单层的速度也有关，接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。（4）P 细胞生长的PH为6.67.8,但最适PH 7.07.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。细胞代谢产生的各种酸性物质可使P下降。（5）温度 细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物提温一致，在此基础上，如升高12，则对细胞产生不良影响，甚至在24h内死亡。低温对细胞影响小，在2025时对细胞仍可缓慢生长。 此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操
11、作及洁净的培养器皿。1.2细胞生长的三个阶段 1）潜伏期细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（2496h）；连续细胞系时间短（1030min）。2) 指数生长期细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细
12、胞标志之一。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制。3)停滞期即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。1.3细胞的培养方法1.3.1细胞培养的类型1、原代细胞（primary cell）动物组织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在生长于培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一，鸡胚成纤维细胞（CEF）4h左右即可贴壁，24h可长成致密单层，肾和睾丸生长较慢，原代细胞一般对病毒较易感染，尤其
13、是来源于胚胎或幼畜组织的细胞2、二倍体细胞株（diploid cell strain）将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化，例如培养猪瘟用的犊牛睾丸细胞、猪传染性胃肠炎用的乳猪肾细胞3、传代细胞系（establishell cell line）与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂的异倍体癌变细胞。优点：传代及培养方便，可节约元材料，因此使用广泛。缺点：1有的对分离的野毒不敏感；2实验室传代日久，可能污染支原体、霉形体、或隐性感染病毒。1.3.2细胞培养
14、的方法1、 静止培养 将细胞悬液接入培养瓶或培养板中置于恒温箱内或温室中静止培养，细胞成长繁殖成单层或克隆。静止培养是最常用的细胞培养方法，广泛用于病毒研究和生物制品制造。例如扁瓶、细胞培养板 ，一般需在37含5%的二氧化碳条件下培养。2、旋转培养 将细胞液接入转瓶后放于恒温箱的转瓶机上，转数一般为10-12转/h。3、悬浮培养是通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于细胞培养液内的方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产但克隆抗体的杂交瘤细胞。对于正常细胞（贴壁依赖性细胞）某些传代细胞不适用，这些细胞在悬浮下很快死亡。4、微载体培养微载体一细小的颗粒未细胞在载体，通过搅拌悬
15、浮在培养液内使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。5、中空纤维细胞培养 该技术模拟动物体内环境，使细胞能在中空纤维上形成类似组织的多层细胞生长，细胞周围犹如密布微血管，可以不断获得营养物质，同时又可将细胞代谢产物、废物和分泌物送到培养液中被运走。系统由中空纤维生物反应器、培养及容器、供养其和蠕动泵组成。1.3.3单细胞的制备1、原代细胞的制备 原代细胞制备时首先选取适当组织或器官，如鸡胚体、犊牛睾丸、乳猪肾等，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为小块（约为1mm3 ）然后用0.25%.5%胰酶(ph7.47.6)消化掉细胞间的组织蛋白,消化的时间长短与温度
16、、组织的来源及大小等有关，一般37 消化1030min，消化需要过夜。消化好的组织块去掉胰酶经吹打成分散的细胞，用于培养3。2、传代细胞的制备 单层细胞传代时多采用EDTA（乙二胺四乙酸二钠）-胰酶消化法，胰酶浓度为0.025%,其作用是消化细胞间的组织蛋白;EDTA 浓度为0.01%其作用是螯合维持细胞间结合的钙镁离子和细胞与细胞间的钙镁离子，使细胞易脱落和分散。单层细胞经EDTA-胰酶消化，洗涤23次，再加入少量消化液消化，待细胞刚刚圆缩时即可加入营养液轻轻吹打，使之分散为单细胞。某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/0瘤细胞，不需要消化，采用机械吹打即可形成单细胞。3、细胞冻存与复苏
17、细胞株与细胞系均需要保存于液氮中（-196）。为防止细胞在冻存过程中因渗透压、PH值等变化以及机械损伤而影响活力，须向培养液中加入亲水性强、毒性小、易通过细胞膜的DMSO（二甲基亚砜）作为保护剂，从而使冰点降低，在缓慢冻结下能使细胞水分在冻结前透过细胞外，以防止细胞内形成冰晶对细胞造成的伤害。DMSO终浓度为5%15%，常用10%。 为保持细胞最大活率，一般采用慢冻快融法。常用冷冻速度为每分钟下降12，当当温度达-25时，速度可增至510/min，到-100时则可迅速浸入液氮中。也可采用如下程序：取对数生长期细胞消化后离心，将细胞沉淀用冻存液（10%DMSO，20%犊牛血清，70%MEM）悬浮
18、至200万500万/ml细胞数，分装于细胞冻存管后4放置1h，然后-20冰箱放置2h，再放入-70冰箱4h后放入液氮保存。复苏时要求快速融化以防止损害细胞。通常将从液氮中取出的细胞管置37-40水浴40-60s融化，离心后除去冻存液，然后将细胞悬浮于培养液中培养。必要时待细胞完全贴壁后换液一次，以防止残留的DMSO对细胞有害。细胞在液氮中可贮存3-5a。通常，每冻存1a应再复苏1次。1.3.4细胞培养注意事项：1、准备好细胞培养所需的各种器材、营养液、胰酶消化液、血清、细胞等，并且各种用品都要有标签，注明名称、规格、数量、配制日期、批号等信息。2、无菌室要进行全面的清理和消毒。3、无菌操作要求
19、：（1）操作前一定要按要求进行洗手、手消毒、更换无菌衣。手指不能接触器材的使用端，如触及需要更换或烧灼后再使用。（2）减少手与器材的接触面积，学会用手指进行操作。（3）一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行，使用端用前要经过火焰消毒。（4）瓶口要顺风放在支架上，试剂使用后应立即封闭瓶口，若长时间敞口，会增加落菌的机会。（5）细胞培养各种试剂要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。（6）瓶口的液滴不能再倒回瓶内，要用干酒精棉球擦拭，瓶口要再用火焰消毒。（7）操作者动作准确敏捷，尽量避免空气流动。2 细胞培养技术的应用研究2.1 在病毒学中的应用培养细胞为病毒
20、的增殖提供了场所，细胞是分离病毒的基质，体外培养细胞无抗体及非特异颉颃物质的影响，而且对病毒的敏感性较体内细胞高，可采用离心感染法或提取病毒核酸进行感染，并以细胞打孔器协助感染扩大病毒感染的宿主范围，使病毒感染指标容易观察，光学显微镜下就可见到包涵体、细胞融合等现象，同时也便于用分子病毒学技术进行检测。乙肝病毒（BV）的感染可引发急、慢性病毒性肝炎，还与肝硬化、肝细胞癌的发生和发展有密切关系。肝源细胞模型对研究BV生物学特性、BV的致病机制、BV基因组的复制、表达和调控、体外抗病毒药物的筛选发挥了重要作用，大大促进了对BV的研究 4 。通过细胞培养技术，可了解猪轮状病毒的培养特性，建立其分离方
21、法以及FQ-PCR检测方法，为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。使用细胞培养研究鱼类病毒可以减少隐性感染机率和个体差异引起的误差，使试验结果更加准确迅速，可建立细胞株（系）分离和鉴定鱼类病毒，进行生物学、病理学和流行病学研究，具有非常重要的意义 5-6 2.2 在肿瘤学中的应用肿瘤是机体在致癌因子的作用下，组织中的细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前对于各种癌症还没有有效的药物来治疗，肿瘤研究的首要任务是明确致癌机制。细胞培养技术使研究人员能够清楚地认识正常细胞、癌前病变细胞、生命有限的肿瘤细胞以及完全转化或永生化的肿瘤细胞的生物学特征，这些逐级进化的细胞是体外研究
22、多阶段致癌机制的基础。体外血管模型主要研究血管的生理和病理以及药物的作用，根据培养方式不同可以分为二维和三维血管 7-8 。2.3 在药理学中的应用细胞培养在药理学中的应用比较广泛。通过培养细胞的生长曲线可计数细胞增长的绝对指数，从而可以直观地了解细胞生长与死亡的动态变化，一般用于检测各种药物对细胞生长的影响。利用培养细胞的放射自显技术，研究细胞的物质代谢、动态变化和细胞周期等，对于药物作用机制的研究有重要作用。细胞培养可用于抗动脉粥样硬化、血糖等药物的研究等应用。2.4 在动物生产中的应用细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术，在生物领域中占有重要地位。动物组织（细胞）培养开始于20
23、世纪初，发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法，目前这项技术也广泛应用于动物生产的研究。球虫是一类寄生于鸡等动物肠道上皮细胞引起的一种原虫，广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。而细胞培养为球虫研究提供洁净无污染的环境，为研究抗球虫药物的作用机制、活性以及球虫的发育、行为、结构、免疫、遗传、细胞化学和生物化学等方面提供更有效的研究工具7。2.5 在其他方面的应用细胞培养技术可用于有毒物质的毒性机理的研究。可利用体外培养动物细胞来研究氟化物的毒性机制8。木脂素类、黄酮等活性物质是植物的次生代谢产物，其具有抗肿瘤、抗氧化等多种功能，现在可以利用细胞培养技术从植物细胞获取
24、。利用连翘叶子的悬浮细胞可进行培养提取木脂素；可利用银杏液体悬浮细胞培养生产黄酮、药材金铁锁细胞培养生产皂苷等9。3 小 结细胞培养技术经过不断的研究和完善，已经成为实验室常用的研究方法，广泛应用于农业、医药学等领域11。目前，动物细胞培养可以降低试验成本、避免浪费等优点也逐渐应用于在动物生产中。但细胞培养只是在模拟机体内的生理环境，使细胞维持生长、繁殖的技术，相对于机体这个系统来讲，存在很大的差异，会导致细胞或组织的形态或功能发生不同程度的改变，因此试验的结果不能等同于在体内研究的结果。1李勇.细胞培养在水产养殖中的应用J.才智, 2011（18）:92-93.2刘流.联合细胞培养在组织工程
25、中的研究进展J.昆明医学院学报, 2010（3）: 1-3.3张卓然.培养细胞学与细胞培养技术M.上海:上海科学技术出版社, 2004.4段彪,申元英.乙肝病毒肝源细胞培养模型的研究进展J.中国病原生物学杂志, 2011, 6（8）: 618-620.5魏锁成,巩转娣,宋昌军.猪轮状病毒的细胞培养特性与FQ-PCR检测方法的建立J.中国兽医学报, 2011, 31（3）: 373-377.6李文峰,麦康森,黄倢,等.鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用J.动物医学进展, 2010, 31（5）: 107-110.7 Ladakis S M, Nerem R M. Endothelial cel
26、l monolayer formation:effect of substrate and fluid shear stressJ. Endothelium, 2004, 11（1）: 29-44.8 Opdenbuijs J, Musters M, Verrips T, et al. Mathematical modelingof vascular endothelial layer maintenance: the role of endothelialcell division, progenitor cell homing, and telomere shorteningJ.Ameri
27、can Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2004, 287（6）: 2 651-2 658.9徐燕,王丹,谢尧,等.人卵巢癌微血管内皮细胞的培养及体外管腔样结构形成的观察J.第三军医大学学报, 2010, 32（3）:201-20510马晓雯,刘彤,孙力超,等.人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究J.广西医科大学学报,2011, 28（2）: 187-191.11阳海鹰,丁巍,丁爱石,等.新生小鼠心肌细胞培养模型的建立及其在毒性评价研究中的应用J.军事医学科学院院刊,2010, 34（1）: 30-33.
