elisa试剂盒

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1、elisa 试剂盒Elisa 试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其 试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学 检验的各领域中。ELISA 检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗体 ELISA 检测。 目 录 1elisa 试剂盒简介 2 优点 3 回收率 4 发展 5 使用方法 6 制备方法 7 影响 8 检测原理 9 操作步骤 10 试剂器材 elisa 试剂盒简介 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相 载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗

2、体既保留其免 疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原） 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原 抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反 应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比 例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受 检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催 化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 然而，影响 Elisa 试验结果的因素很多，故加

3、强各个环节的质量保证才能 充分发挥其方法学的优点。2 优点一、高效、灵敏、特异的抗体；二、稳定的重复性和可靠性；三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本 类型；五、节省实验经费。3 回收率elisa 试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越 少，回收率越高，如果作标液 1PPM，就是 1 毫克/升，而作出标准数据为 0.99 毫克/升，就是说你的回收率是 99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法 的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯 20mg/L，取 100mL 被测水样品，加入

4、 0.1mL 浓度为 10mg/mL 的含无机氯标准样品，测定 时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为 2.98mg/L，则认为回收率为 99%。4 发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂 生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定 会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的 影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测 定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。5 使用方法1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。 收集血液后，1000g 离心 10

5、 分钟将血红细胞迅速小心地分离。 2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000g 离心 30 分 钟去除颗粒。 3、 细胞上清液：1000g 离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。 4、 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000g 离心 10 分钟，取 上清液。 5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70保存，避免反复 冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离 心或过滤。不要在 37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均 匀地充分解冻。6 制备方法包括以下步骤： 1)抗原表位的计算机筛选； 2)抗原的制备； 3)血清的采集；4

6、)间接 ELISA 方法的建立； 5)间接 ELISA 方法的敏感性和特异性验证； 6)试剂盒的稳定性验证； 7)对屠宰场进行临床检测。该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳 定性合格、重复性好。应用本发明制得的试剂盒能有效检出感染猪的戊型肝炎 病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控 制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。7 影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的 诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通 常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用 杂交瘤技术得到的单克隆

7、抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各 种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制 备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试 剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。 HBsAg 试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。 多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与 HBsAg 有不同 结合位点的鼠复合单位，可测得 HBsAg 变异样品，提高检测的特异性（99.98%） 提高检测的灵敏度，应用 Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg 标准品，对 ad 标准 品的灵敏度为 0.05ng/ml 对 a

8、y 标准品灵敏度为 0.025ng/ml8 检测原理ELISA 检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的 HEV 多肽抗原 包被微孔板板条，这些多肽是中国型 HEV 毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的 肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框 2 和开放阅读框 3。将样品或标准品加 入孔中并孵育，如果其中存在 HEV IgM 抗体，这些抗体就会与 HEV 的多肽抗 原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然 后加入羊抗人 IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结 合物就会与第一次孵育结合上的 HEV IgM 抗体相结合，洗板除去未结合的酶结 合物，加

9、入 TMB 底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含 有 HEV IgM 抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸 溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm 处测量 O.D.值,按照本 HEV IgM 抗体 elisa 试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于 Cut-Off 值的样品被认为 是初试阳性。9 操作步骤方法一双抗体夹心法 1.包被：用 0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 110g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4 过夜。次日，弃去 孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3 次，每次 3 分钟。（简称洗涤，下同

10、）。 2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37 孵育 1 小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的 稀释度）0.1ml。37 孵育 0.51 小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37 1030 分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越 深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-” 号表示。也可

11、测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm（若以 ABTS 显色， 则 410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。方法二间接法 1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至 110g/ml，每孔加 0.1ml，4过夜； 2.次日洗涤 3 次； 3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37孵育 1 小时,洗涤； 4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标 第二抗体（抗抗体）0.1ml； 5.37孵育 35-60 分钟，洗涤； 6.最后一遍用 DDW 洗涤。 其余步骤同“双

12、抗体夹心法”的 4、5、6。10 试剂器材试剂（1） 包被缓冲液（PH9.60.05M 碳酸盐缓冲液）: Na2CO3 1.59 克 NaHCO3 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml （2） 洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO4 0.2 克 Na2HPO412H2O 2.9 克 NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml （3） 稀释液： 牛血清白蛋白（BSA） 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成 510%使用。 （4） 终止液（3M H2SO4）： 蒸馏水 178

13、.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。 （5） 底物缓冲液（PH5.0 磷酸枣柠檬酸）: 0.2MNa2HPO4（28.4 克/L）25.7ml 0.1M 柠檬酸（19.2 克/L） 24.3ml 加蒸馏水 50ml。 （6） TMB（四甲基联苯胺）使用液: TMB（10mg/5ml 无水乙醇）0.5ml 底物缓冲液（PH5.5） 10ml 0.75%H2O2 32l （7） ABTS 使用液: ABTS 0.5mg 底物缓冲液（PH5.5） 1ml 3%H2O2 2l （8） 抗原、抗体和酶标记抗体。 （9） 正常人血清和阳性对照血清。器材（1） 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40

14、孔或 96 孔，ELISA 检测仪， 50l 及 100l 加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 （2） 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 （3） 4冰箱，37孵育箱。11 注意事项做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作 一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应， 可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。实验条件的选择在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: （1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙 烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用 的是 40 孔

15、聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量 抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判 明其吸附性能是否良好。 （2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表 面时，要求纯度要好,吸附时一般要求 PH 在 9.09.6 之间。吸附温度，时间及 其蛋白量也有一定影响,一般多采用 4 1824 小时。蛋白质包被的最适浓度 需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0 和 10g/ml 等）进行包被后， 在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最 少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 110g/ml。

16、（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELISA 法进行初步效价 的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、 待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确 地滴定其工作浓度。 （4） 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有 明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如 OPD 等）有潜在的致癌作用， 应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反 应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其 是 H2O2 在临用前加入。12 清洗试验原理试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知浓度的标准品、未 知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。 洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合 物，然后加入底物 A、B，和酶结合物同