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1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号SN中华人民共和国 出入境 行业标准SN/T XXXXXXXXX猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范Quarantine Protocol for Teschovirus Encephalomyelitis点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（送审稿）（本稿完成日期：）XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发 布SN/T XXXXXXXXX前 言本标准是按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准参照国际动物卫生组织（OIE） 陆生动物诊断试验和疫苗标准手册 （2012 版）
2、（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,2012）第 2.8.10 章规定的主要诊断技术制定的。两者的主要差异是：本标准未采用第 2.8.10 章提出的聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：上海出入境检验检疫局、福建出入境检验检疫局本标准主要起草人：张强、熊炜、王巧全、李树清、李健、张志灯、王艳、蒋静SN/T XXXXXXXXX猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范1 范围本标准规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附
3、试验的技术规范。本标准适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和分析方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样3 缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1 CPE 细胞病变3.2 ELISA 酶联免疫吸附试验3.3 EDTA 乙二胺四乙酸3.4 FITC 异硫氰酸盐荧光素3.5 IBRS-2 猪肾细胞系3.6 OD值 光密度值3.7 PBS 磷酸盐缓冲液3.8 PK15 猪肾
4、细胞系3.9 PTV 猪捷申病毒3.10 ST 猪睾丸细胞系3.11 TCID50 组织培养半数感染量3.12 Tris 三羟甲基氨基甲烷4 临床诊断4.1 临床症状SN/T XXXXXXXXX急性捷申病毒性脑脊髓炎由于病毒毒力和感染量的不同，其潜伏期范围为 4d28d。发病初期体温升高，可达 4142，甚至更高。病猪精神较差，厌食，后肢动作失调。随着病情的发展，会出现脑炎症状，如四肢僵硬、眼珠震颤、抽搐甚至出现阵挛性惊厥。受到刺激时会出现角弓反张。在最后临床期，可见到全身麻痹，温度调节中心的麻痹导致高温，当呼吸肌麻痹可致动物死于窒息。病猪一般在出现症状后 3d4 d 死亡。个别病例会拖延数月
5、或不死，但常会留下肌肉萎缩和麻痹的后遗症。亚急性捷申病毒性脑脊髓炎症状较温和，发病率和死亡率较低。14 日龄内的猪发病较常见且症状严重，极幼龄猪的发病率和死亡率可达 100%，3 周龄以上猪较少发病。该病发生迅速，消失也迅速。病猪食欲不振，体温略有升高。神经症状通常数日后出现。14 日龄内的仔猪表现感觉过敏，共济失调，向后退着走，呈犬坐姿势，最终会出现脑炎症状。4.2 病理学变化剖检常无肉眼可见病变，仅可见到脑、脑膜充血和水肿。死亡胎儿可见皮下和大肠等肠系膜水肿，胸腔、心包积液，脑膜和肾皮质可见小出血点。病理组织学变化为在脊髓、脑干和小脑血管周围淋巴细胞浸润，形成血管套，病灶性神经胶质增生，神
6、经元坏死和嗜神经细胞作用引起非化脓性脑脊髓炎。患病后期会出现神经元变性（肿胀、溶解、坏死、嗜神经现象、轴突变性） ，并逐渐转变成星形胶质细胞增生。病毒在消化道及其有关淋巴结内增殖，引起病毒血症。在肺的心叶、尖叶和中间叶有灰色实变区，肺泡及支气管内有渗出液。严重的出现心肌坏死和浆液性纤维素性心包炎病变。4.3 流行病学本病仅见于家猪和野猪，不同年龄和品种的猪均有易感性，幼龄猪比成年猪更易感，成年猪多为隐性感染。其中急性型的发病率为 50%，致死率为 70%90%，哺乳仔猪感染后几乎 100%死亡。亚急性型的发病率 5%左右。全世界范围均有发生。病猪和带毒猪为主要传染源，以隐性感染猪为主。病毒可通
7、过粪便排出，污染饲料和饮水，经消化道感染。病毒也可通过飞沫和气溶胶进行传播，猪群经呼吸道、眼结膜、生殖道黏膜感染等多种方式感染。猪群感染 PTV 后，带毒时间较长，怀孕母猪带毒期为 3 个月，病毒可通过胎盘感染胎儿。另外，本病可通过人和动物的运输、移动而间接传播。5 实验室诊断5.1 采样SN/T XXXXXXXXX5.1.1 采样标准按 GB/T 18088 规定采样。5.1.2 病料的采集将发病猪扑杀，无菌采集宰猪的脑和脊髓样品。疑似病例，也可采集粪便样品。如不能立即鉴定，样品需置于 pH7.4 等渗磷酸甘油缓冲液（等体积的 0.01mol/L pH7.4PBS 和甘油）中。5.1.3 血
8、样的采集制备无菌采集动物血，每头不少于 5mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封，做好标示后冷藏保存。5.2 病毒分离5.2.1 设备、材料和试剂本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.2.1.1 PTV 标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.2.1.2 细胞：PK15、IBRS-2、ST 细胞系或猪肾原代细胞。5.2.1.3 胎牛血清： 56水浴灭活 30min。5.2.1.4 细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS 缓冲液、病毒培养液：见附录 A。5.2.1.5 生物安全柜。5.2.1.6 倒置显微镜。5.2.1.7
9、二氧化碳培养箱。5.2.1.8 可调单通道微量移液器（20L 200L，100L 1000L） 。5.2.1.9 冷冻离心机。5.2.2 病料处理5.2.2.1 将组织块切碎，研磨，用 PBS 制成质量浓度为 10%的悬液； 5.2.2.2 组织悬液 800g 离心 10 min；5.2.2.3 每毫升上清液加入 100IU 青霉素和 100mg 链霉素，4放置 12h；5.2.2.4 上清液用于接种单层细胞培养物。5.2.3 操作步骤长满单层细胞的细胞培养瓶弃去生长培养基，在细胞瓶内接入 1mL 可疑组织上清液；接种的细胞SN/T XXXXXXXXX瓶置 37培养箱感作 1h；倒掉接种液，细
10、胞层用无菌 PBS 洗 12 次，补充无胎牛血清维持液；置37 二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞病变，连续观察 3d4d，若不出现细胞病变，则收取培养物，反复冻融 3 次后接种到长满单层的细胞上盲传 3 代。出现细胞病变者，收取培养物，-70以下保存待鉴定。同时设未接种的细胞对照。5.2.4 结果判定5.2.4.1 对照细胞正常，接种样品的细胞盲传 3 代后无细胞病变者，判为阴性。5.2.4.2 PTV 典型细胞病变特征是出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE 增多到所有细胞脱壁。经过传代后病毒生长良好，一般在 24h48h 后产生完全的 CPE。5.2.4.3 出现上述典
11、型细胞病变的培养物，可用特异性抗血清或单克隆抗体鉴定。病毒中和试验或间接免疫荧光试验是理想的鉴定方法。若用血清学方法将分离毒株确定为 PTV，则进一步用仔猪接种试验确定其致病性。5.3 病毒中和试验5.3.1 设备、材料和试剂本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.3.1.1 PTV 标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.3.1.2 细胞：PK15、IBRS-2、ST 细胞系或猪肾原代细胞。5.3.1.3 胎牛血清： 56水浴灭活 30min。5.3.1.4 细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS 缓冲液、病毒培养液：见附录 A
12、。5.3.1.5 生物安全柜。5.3.1.6 倒置显微镜。5.3.1.7 二氧化碳培养箱。5.3.1.8 可调单通道微量移液器（20L200L，100L1000L） ，可调式多通道移液器（20L 300L） 。5.3.2 操作步骤从细胞培养物中收获的分离物用维持液从 10-1到 10-6作 10 倍梯度稀释。若鉴定捷申病毒血清型，每个梯度都要有对应的血清型，则需要加 12 排。50L 1：10 稀释的 PTV-111 标准阳性血清加到111 排孔内，50L 标准阴性血清加到最后一排。振荡混匀后混合物置 4反应过夜或 37反应 1h，随后转入长满单层培养物的微孔板孔内。接种后细胞置 37 二氧化
13、碳培养箱继续培养。72h 后开始观SN/T XXXXXXXXX察细胞病变，其后每天 1 次，根据 CPE 出现情况，一直观察 10d。5.3.3 结果判定如果分离物在哪一种阳性血清对应排的滴度比阴性血清排低 103以上，就可确定该分离病毒属于这种血清型。5.4 间接荧光抗体试验5.4.1 设备、材料和试剂本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.4.1.1 PTV 标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.4.1.2 细胞：PK15、IBRS-2、ST 细胞系或猪肾原代细胞。5.4.1.3 FITC 标记的兔抗猪 IgG：购买商品化试剂，
14、按说明书稀释。5.4.1.4 0.01%伊文斯兰：见附录 A。5.4.1.5 0 .1mol/L pH8 . 6 的 Tris 甘油缓冲液：见附录 A。5.4.1.6 荧光显微镜。5.4.1.7 37恒温培养箱。5.4.1.8 可调单通道微量移液器（20L200L，100L1000L） 。5.4.2 操作步骤5.4.2.1 把可疑分离物接种在长满单层细胞的多孔载玻片上。同时进行阴、阳性样品对照试验。5.4.2.2 12h16h 后将细胞玻片取出，用 PBS 冲洗 3 次，冷丙酮固定 5min15min。5.4.2.3 将细胞玻片放入湿盒内，加入用 PBS 1 : 10 稀释的 PTV 标准阳性
15、血清。5.4.2.4 盖好湿盒，置 37孵育 60min。5.4.2.5 取出细胞玻片，用 PBS 冲洗 3 次，然后加入 0.01%伊文斯兰稀释的 FITC 标记兔抗猪荧光抗体。置 37孵育 30min。5.4.2.6 细胞玻片用 PBS 冲洗 3 次，风干，用 0 .1mol/L pH8 . 6 的 Tris 甘油缓冲液封片。5.4.3 判定标准细胞玻片经处理后，用荧光显微镜检查，首先观察对照片，确证特异性荧光。特异性荧光为苹果绿色，并位于细胞浆中和细胞核外周。5.5 微量血清中和试验5.5.1 设备、材料和试剂SN/T XXXXXXXXX本标准所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的
16、规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.5.1.1 PTV 标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.5.1.2 细胞：PK15、IBRS-2、ST 细胞系或猪肾原代细胞。5.5.1.3 胎牛血清： 56水浴灭活 30min。5.5.1.4 细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS 缓冲液、病毒培养液：见附录 A。5.5.1.5 生物安全柜。5.5.1.6 倒置显微镜。5.5.1.7 二氧化碳培养箱。5.5.1.8 可调单通道微量移液器（20L200L，100L1000L） ，可调式多通道移液器（20L 300L） 。5.5.2 操作步骤5.5.2.1 将血清置 56水浴中灭活 30min。5.5.2.2 用细胞培养液将待检血清在 96
