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1、ICS 点击此处添加中国标准文献分类号SN中华人民共和国 出入境检验检疫 行业标准XX/T XXXXXXXXX代替 SN/T 1174-2003猴 D 型逆转录病检疫技术规范Quarantine protocol for type D simian retroviruses 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期：2012-10-01）XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局 发 布/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。 本标准代替SN/T 1174-20
2、03猴D型逆转录病抗体检测方法本标准与SN/T 1174-2003主要的技术性差异如下：增加了病原的分离及鉴定。增加了反转录聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局本标准主要起草人：艾军，杨俊兴，杨云庆，张光培，叶玲玲，祝贺，周晓黎，董俊本标准所代替标准2003年首次发布，本次为第一次修订。/T XXXXXXXXX1猴 D 型逆转录病检疫技术规范1 范围本标准规定了猴D型逆转录病毒的病原分离、鉴定，血清抗体检测方法。本标准适用于猴D型逆转录病毒的检测、抗体的流行病学调查。2 规范性引用文
3、件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088 出入境动物检疫采样3 疾病概述猴 D 型逆转录病毒。其病原、流行病学、临床症状参见附录 A。4 现场检验检疫及采样 4.1 现场检验检疫 逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。4.2 采样 按 GB/T18088 标准规定，逐头进行采样，并按规定填写送样单送实验室。5 缩略语5.1 SRV，D type simian retroviruses 猴 D 型逆转录病毒 5.2 CPE，cytop
4、athic effect细胞病变作用5.3 RT-PCR反转录聚合酶链式反应5.4 DEPC，diethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯5.5 Trizol/T XXXXXXXXX2酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液5.6 AMV-RT鸟成骨髓细胞白血病病毒的逆转录酶 6 病毒分离及鉴定6.1 病毒分离6.1.1 试剂与材料6.1.1.1 Raji 细胞。6.1.1.2 培养液：1640 培养基中加入 10%的胎牛血清。6.1.1.3 维持液和稀释液：维持液为 1640 培养基中加入 2%的胎牛血清。稀释液为维持液不加 2% 的胎牛血清。6.1.2 设备6.1.2.1 倒置光学显微镜。6
5、.1.2.2 二氧化碳培养箱。6.1.2.3 研钵、离心机。6.1.2.4 可调微量移液器。6.1.2.5 细胞培养瓶、细胞培养板等。6.1.3 样品采集与处理6.1.3.1 血液、唾液样品采集与处理：取血浆、唾液等样品，按 1:5 比例加入稀释液, 置乳钵中研磨，3 000r/min 离心 20min，取上清液， 0.45m 滤膜过滤，置-70保存备用。6.1.3.2 组织样品采集与处理：无菌采集动物淋巴结、器官组织样品，剪碎后加入稀释液 10mL（含青霉素 2 000IU/mL、链霉素 2 000g/mL），置乳钵中研磨，3 000r/min 离心 20min，取上清液，0.45m 滤膜过
6、滤，置-70保存备 用。6.1.4 接种敏感细胞6.1.4.1 处理后的样品按 1:10 比例接种于悬浮的 Raji 细胞。6.1.4.2 37 5% CO2培养箱中培养，24h 后逐日观察细胞病变(CPE)，连续观察 5d-7d。6.1.5 判定盲传2代，无细胞肿大、死亡等病变现象(CPE)出现，判为病毒分离阴性；出现细胞病变，则需进 一步进行鉴定。/T XXXXXXXXX36.2 病毒鉴定采用RT-PCR等方法进行。7 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）7.1 试剂和材料7.1.1 引物根据 p27 蛋白编码基因保守序列设计，其引物序列如下：引物 A：5- CCAGTAACGGAGACT
7、ATGGATGGACAAG -3；引物 B：5- CATTGCCAGACCTTGCTGGTAAGAGGG -3； 扩增产物为 678bp，扩增参考序列见附录C。7.1.2 反转录试剂Trizol，AMV-RT（13U/L），dNTPs（10mmoL/L），RNasin（40U/L），Taq DNA 酶 （5U/L），RT-PCR 和 PCR 缓冲液，电泳缓冲液（TBE，配制见附录 B），溴化乙锭溶液 （10mg/mL，配制见附录 B），DEPC 水（ 配制见附录 B），琼脂糖，DNA 分子量标准，随机引物 （25m）。7.2 设备高速冷冻离心机、PCR 仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统7.3 操作
8、方法7.3.1 对照样品制备阳性对照:感染 SRV 病毒的细胞培养物。阴性对照:正常 Raji 细胞或未感染动物的红细胞。7.3.2 RNA 提取7.3.2.1 在样品处理区进行(除本标准规定的方法外，也可采用其它等效的 RNA 提取方法，具体操 作见有关试剂说明书)。所有 RNA 提取器皿用 DEPC 水浸泡 24h，灭菌后方可使用。7.3.2.2 取 n 个 1.5mL 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每管进行编号标记。7.3.2.3 每管加入 750L Trizol，然后分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各 250L，混匀， 静
9、置min；再加入 200L 三氯甲烷，混均，静置 5min，于 4条件下，12 000r/min 离心 15min。/T XXXXXXXXX47.3.2.4 取相同数量的 1.5mL 灭菌 Eppendorf 管，加入 500L 异丙醇（-20预冷），对各个管进行 对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取 500L（注意不要吸出 中间白色絮状层），轻轻颠倒均匀。7.3.2.5 于 4条件下，12 000r/min 离心 15min。取出 Eppendorf 管，轻轻倒去上清液，加入 1mL75%乙醇，颠倒洗涤。7.3.2.6 于 4条件下，12 000 r/min 离
10、心 15min。取出 Eppendorf 管，轻轻倒去上清液，倒置于吸 水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.3.2.7 每管加入 20L 灭菌 DEPC 水，轻轻混均，溶解管壁上的 RNA，2 000r/min 离心 5s，冰上 保存备用。提取的 RNA 须在 2h 内进行 RT-PCR 扩增或放置于-70冰箱备用。7.3.3 cDNA 的合成7.3.3.1 RNA 的变性：在 eppendorf 管中依次加入：随机引物（N6），2L；提取的 RNA 7L ；DEPC 水，5L。瞬时离心，70 10min，冰浴 2min。3 000r/min，瞬时离心 30s。7.3.3.2
11、 反转录：于 7.3.3.1 eppendorf 管中依次加入：5反转录酶缓冲液， 4L；dNTPs，1L；RNasin，0.5L；AMV 反转录酶，0.5L。瞬时离心，42 60min；70 15min；冰浴 3min，立即进行 PCR 扩增或-20保存备用。7.3.4 PCR 扩增反应 7.3.4.1 在 PCR 管中依次加入以下试剂：10PCR 缓冲液 5L，dNTPs 1L，Taq DNA 酶 0.5L， 引物 A (25M) 1L，引物 B (25M) 1L，cDNA 5L，DEPC 水，36.5L。7.3.4.2 反应管瞬时离心，置 PCR 仪内运行下列程序：94预变性 2min；
12、94 30s，52 30s，72 30s，运行 35 个循环；72 7min；4保存。 7.3.5 PCR 产物的检测7.3.5.1 1.0%琼脂糖凝胶的制备，见附录 B。7.3.5.2 取两次扩增产物各 10L 与载样缓冲液混合，分别加入凝胶孔中。恒压 58V/cm，电泳 30min60min；紫外检测仪下观察结果、照像。7.3.5.3 结果判定: PCR 扩增后，阳性对照出现一条 678bp 的特异 DNA 条带。阴性对照和空白对照没有核酸条带。在阳性样品 PCR 扩增出现目的核酸条带，而阴性对照和空白对照均成立的情况下，进行检测样品的判定。待检样品 PCR 扩增物，经电泳出现 678bp
13、 的 DNA 条带，初判为病毒核酸阳性。取初判为病毒核酸阳性 PCR 产物进行测序，如与 SRV 参考序列同源性较高，则综合判为病毒核酸阳性。8 酶联免疫吸附试验/T XXXXXXXXX58.1 试剂和设备8.1.1 试剂8.1.1.1 抗原：SRV 感染 Raji 细胞，100%病变后收获培养液，反复冻融二至三次，4 3000r/min 离心 20min,取上清液备用。8.1.1.2 抗体 鼠源性 SRV 单克隆抗体。8.1.2 设备酶标仪，可拆 96 孔酶标板，单孔道、多孔道可调微量移液器、37恒温箱。8.1.3 试验程序8.1.3.1 用 pH 9.6 的包被液稀释抗原，加入酶标板，每孔
14、 100L,4 度过夜。8.1.3.2 洗板取出酶标板弃去液体，每孔加洗液200 L，洗板，共三次。最后一次倒置拍干。8.1.3.3 封闭每孔加封闭液 100L，37反应 1 h；8.1.3.4 洗板按8.1.3.2 操作。8.1.3.5 加样样品、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照用稀释液作 1：5 稀释，混匀，加入 ELISA 反应板，每孔 50L；37反应 1 h；8.1.3.6 加 SRV 单克隆抗体每孔加50 L SRV单克隆抗体工作液，震荡混匀。37作用30min。8.1.3.7 洗板按8.1.3.2 操作。8.1.3.8 加酶结合物各孔加50L羊抗鼠IgG-HRP，轻轻混匀。酶标板
15、置37作用30min。8.1.3.9 洗板按8.1.3.2 操作。8.1.3.10 加底物液每孔加 100 L 底物液，37作用 10min。8.1.3.11 终止反应/T XXXXXXXXX6取出反应板，每孔快速加入100L终止液，在30 min内测其OD值。8.1.3.12 测吸光值 用酶标仪在 450nm 波长下，测定其吸光值。8.1.3.13 结果计算8.1.3.13.1 计算抑制百分比（PI）：被检血清平均OD值抑制百分比（PI）=100 100阴性血清平均OD值8.1.3.13.2 结果判定强阳性对照、弱阳性对照 PI50% ，阴性对照 PI 50%的条件下，进行判定。被检血清抑制
16、百分比PI50%，判为 SRV 抗体阳性，PI 50% 判为被检血清 SRV 抗体阴性。9 Wester Blot 检测9.1 仪器和设备单孔道可调微量移液器、离心机、蛋白凝胶电泳仪、蛋白转膜仪9.2 SDS 凝胶电泳操作程序9.2.1 准备电泳的玻璃夹层，根据生产厂家的说明安装玻璃板。9.2.2 准备分离胶，配制见附录 B，将溶液注入两块玻璃板的孔隙处，直至距边沿短玻璃 2 cm，再 在其上注入去离子水用于封闭分离胶，室温放置约 20 min，待其完全聚合后，倒出去离子水。9.2.3 吸取 5% 的浓缩胶溶液，注入凝固的分离胶上层至所需高度；立即插入适当的梳子，于室温 放置 20 min 左右，直至 5% 的浓缩胶溶液凝固。
