博士学位论文博士学位论文 脊髓缺血再灌住损伤脊髓缺血再灌住损伤摘 要文研究了脊髓缺血－再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion I/R )时微血管内皮细胞粘附分子 ICAM-1 及其调节因子 IL-1β 的表达对血脊髓屏障损害的分子机理，主要结果为：脊髓缺血－再灌注损伤模型建立：通过阻断大鼠腹主动脉造成脊髓腰尾段缺血按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉应用激光多谱勒血流仪，分别连续测定腰髓血流变化取缺血前、缺血 30 分钟、缺血 60 分钟，缺血 30 分钟再灌2h、4h、6h、9h、12h 局部脊髓组织进行组织病理和透射电镜检查结果：在缺血 30 分钟时腰髓局部血灌流量迅速下降至基线值的-81.57%(P 值=2.01E-17) 再灌流时，局部血流迅速增高并超过基线水平再灌流 10 分钟，局部血灌流量与基线的百分比变化值为57.98%(P 值=3.3E)，随后逐渐降低，再灌流 30 分钟后，局部血灌流基本恢复基线水平(31.97% P 值=0.557899)，以后血流量低于基线水平，出现缺血后延迟低灌流直至再灌流4 小时(-23.5%,P 值=1.84E)低灌流保持相对稳定，血流未见恢复。
证实了缺血再灌流进行性延迟性低灌流 ( delayed hypoper fusion)存在说明缺血缺氧本身对脊髓有损伤，而再灌后，在恢复血供条件下，其病理改变加重，揭示了脊髓存在再灌注损伤脊髓微血管内皮细胞与星型胶质细胞紧密连接构成血脊髓屏障，脊髓 I/R 损伤过程中血管内皮细胞是最先波及的部位，因此本实验总结为缺血低灌流是严重脊髓损伤后主要血流变化而延迟性低灌流现象主要与血脊髓屏障损害相关本实验结论：再灌注期脊髓损伤较缺血期明显，表明再灌流后脊髓发生了二次损伤脊髓微循环障碍在脊髓 I/R 损伤中起重要作用血脊髓屏障损害是脊髓 I/R 过程中重要病理基础为深入探讨脊髓 I/R 损伤时血脊髓屏障的基本结构微血管内皮细胞表面粘附分子(Intercellular Adhesion Molecule-1 简称 ICAM-1)的变化作用，以及内源性细胞因子对其表达的调节本实验以暂时性脊髓缺血为活体模型，对微血管内皮细胞表面 ICAM-1、白介素 1-β(Interleukin-1B IL-1β)的基因及蛋白 /多肽水平的表达，以及它们与多核型白细胞(PMN)在脊髓缺血区中浸润间的关系进行了研究重点观察了微血管内皮细胞损伤后粘附蛋白 ICAM-1 表达的变化。
提取各实验组缺血再灌注损伤脊髓组织总 RNA,经反转录合成 cDNA,在特异性 IL-1β、ICAM-1 和 3- 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物存在下，以 GAPDH 为内对照进行多聚酶链反应(PCR),应用地高辛标记 cDNA 探针技术检测脊髓 I/R 损伤后脊髓血管内皮ICAME-1mRNA和 IL/1βmRNA 表达免疫组化及免疫荧光激光其聚焦显微镜(confocal)定性、定量测定脊髓微血管内皮细胞表面 ICAM-1 的表达,MTT 生物检测法定量测定脊髓组织中 IL-1 活性脊髓组织过氧化酶 (MPO)活性测定用于定量反映浸润到脊髓组织中的 PMN数量动物实验表明，正常脊髓微血管内皮细胞表面仅有微量的 ICAM-1 表达，脊髓组织中有基础量的 IL-1 分泌，组织中未见 PMN 浸润，单纯缺血不引起细胞因子和粘附分子表达量的升高，再灌注后，缺血区细胞因子，粘附分子的表达及 PMN 的浸润先后发生了改变再灌注 2h,IL-1βmRNA的表达首先升高，约为对照组的 2 倍其多肽活性(OD 值/g) 随不同灌流时间出现时相变化,再灌注 3h 明显升高, 6h 达到高峰, 并持续到 12h。
再灌注4h，ICAM-1 mRNA 表达量明显升高，再灌注 12h 其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了二分之一，再灌注 9-12h，脊髓组织中 MPO 活性约为单纯缺血组的两倍以上结果提示：①脊髓 I/R 损伤诱导了内源性细胞因子 IL-1β 及微血管内皮细胞表面粘附分子 ICAM-1mRNA的表达,并伴有相应活性多肽及蛋白的合成分泌 ②早期炎性因子IL-1β 在基因和多肽水平的表达与 ICAM-1 相平行，说明损伤区细胞因子和粘附分子共同参与了对损伤组织的炎症应答，并在功能上有联系而 IL-1β 早于 ICAM-1 的表达则提示,I/R 损伤后内源性细胞因子 IL-1β 的分泌可能是调节内皮细胞表达粘附分子的因素之一 ③再灌注损伤有 PMN 的大量聚集,而 ICAM-1 的调节表达与促进循环中的 PMN 与血管壁的粘附、游出血管浸润到周围脊髓组织密切相关 I/R 损伤后脊髓微血管内皮 ICAM-1 及其调节因子 IL -1β 的表达增加是导致血脊髓屏障损害的重要分子基础④IL-1β 对 I/R 损伤后血管内皮 ICAM-1 表达具有调控作用⑤脊髓 I/R 损伤微血管内皮细胞 ICAM-1 的表达为时间性依赖性增加。
⑥再灌注后脊髓损伤 ICAM-1 表达量的增加是白细胞在缺血区粘附到血管壁、游出血管损伤周围脊髓细胞的前提条件和物质基础 细胞外超氧化物歧化酶（EC-SODC）是一种分泌的 SOD 同功酶，与细胞内CuZnSOD 比较，它与血管内皮亲和并有较长的血液半衰期本文目的，研究重组人细胞外超氧化物歧化酶 C 型(rh-EC-SOD)在脊髓缺血再灌区损伤中的保护作用及其对 ICAM-1 表达的影响方法：方法：设立正常组、单纯缺血组、缺血再灌组、缺血再灌治疗组和缺血再灌安慰剂组复制大鼠缺血再灌注损伤模型在再灌注前静脉加入终浓度 rh-EC-SOD200mg/L-1并同时测定脊髓组织乳酸脱氢酶（LDH）、脊髓组织 MDA 含量、CSH－PX 活性和 NO 量，并用RT－PCR 技术检测 ICAM－１表达其结果为缺血再灌注后可引起细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量和 MDA 含量增高,细胞合成释放 NO 量减少而粘附分子 ICAM-1 表达量增加,缺血再灌治疗组 rh-SODC 明显减低 LDC 释放和 MDA 含量,明显抑制细胞粘附分子的表达,结果表明缺血再灌注 ICAM-1 的表达增加和产生的大量自由基是造成脊髓损伤的主要病理因素.rh-SODC 具有改善脊髓的抗氧化能力,通过清除自由基减轻 I/R 对脊髓损伤,并且有抗 ICAM-1过量表达保护脊髓的作用。
关键词: 脊髓缺血再灌注损伤 细胞粘着分子 白细胞介素-1β血脊髓屏障 重组人细胞外超氧化物歧化酶 氧自由基 第第 １１ 部部 分分文文 献献 综综 述述1.1 前言前言脊髓神经元是对缺血缺氧极其敏感的神经细胞，损伤后即刻重新得到血液的再灌注是防止损伤使其存活的必要措施但近些年来却发现在某种损伤因子作用下经过一定时间缺血的脊髓神经在尽管得到血液再灌注却也出现了明 显的功能障碍,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡这种现象称为脊髓缺血再灌损伤(Spinal Cord Ischemia reperfusion injury I/R)引起这些病理改变的原因目前仍不十分清楚炎症反应与缺血再灌注损伤的密切关系已成为共识，而且粘附分子参与再灌注损伤病理过程的研究已成为热点之一[1-5]但是，关于脊髓 I/R 微血管内皮细胞粘附分子表达及与白细胞在再灌注损伤中起何种作用尚未见报道因此，研究粘附分子在脊髓再灌注损伤后对血脊髓屏障损害的分子机制，并通过阻断粘附分子来干预再灌注损伤，使之成为防治脊髓 I/R 损伤的一种有效临床治疗途径，这是本文研究的目的所在现就其这方面 国内外研究工作综述如下：1.2实验性脊髓缺血再灌注损伤机制研究进展实验性脊髓缺血再灌注损伤机制研究进展实验性脊髓 I/R 损伤在脊柱外科领域研究中取得了令人瞩目的成就，已成为神经生物学发展的广阔前沿，为缓解和修复脊髓损伤提供了理论依据。
在其研究领域内选择了部分关键的有关分子和细胞试验,这些重点目标包括 a. 明确及减轻由于创伤、继发炎性反应和纤维化给脊髓造成的损害以及阻止不利于再生的继发因素的形成b.明确各种再生的综合因素及其包括可溶性基质或膜结合性因子,它们相互作用和同时具有营养和抑制作用c.阻止抑制因子的作用;如粘附分子表达1.2.1 关于脊髓缺血再灌损伤模型制备关于脊髓缺血再灌损伤模型制备 1.2.2为了系统化研究脊髓缺血的病理过程及治疗，应用活体动物模型进行生理控制及复制是非常必要的因其发病因素、临床表现及解剖学上差异很大，所以动物试验可以提供对这些差异进行精确的控制和分析[6]， 由于动物模型制备的可行性、稳定性以及与人类脊髓缺血再灌注损伤类似程度直接关系到实验的研究意义和价值因此，建立理想的动物模型仍是目前致力探讨的课题早在 200 年前，Stenonis 即曾结扎犬的降主动脉，造成后肢瘫痪此后，各学者用了不同方法例如压迫主动脉，钳夹主动脉，或在 腹主动脉内置一可充气之气囊以阻塞主动脉之血流Killen 等[7](1965)用犬实验，游离主动脉，按不同平面结扎肋间动脉，结果使脊髓发生缺血性损伤詹名抒等[8](1987)选用健康家犬，显露T10－L2 节段脊髓，用双极电凝器灼闭根动脉和脊髓后动脉，术后动物的后肢皆呈现完全性截瘫，其中 6 只观察 3-37 天，截瘫无恢复。
Zivin [9]等选用腹主动脉夹闭法, 进行局灶性脊髓缺血再灌注模型制作,仍是目前采用主要的实验方法之一 其手术分离腹主动脉至肾动脉水平，在左肾动脉起始部远端用动脉夹夹闭腹主动脉，根据所需时限进行阻断血流这种方法器材简单，操作方便，重复性强，缺血时限确切可以通过控制缺血时间来研究持续不同时间缺血脊髓组织的各种改变和神经功能损伤程度，由此反映缺血神经组织细胞的耐受性及影响因素缺点需要二次手术，增加创伤此外还有其 Sablagen's 法[10]:分离腹主动脉,在肾动脉起始部下方安置可调性体外松解器, 通过体外松解恢复血流或阻断血流动物被处死这段时间内准确判断脊髓损伤程度, 同时避免二次操作及麻醉因素的保护作用与夹闭法相比，这种方法更为精确还有气囊栓塞法[11]和脂肪栓塞法[12]其阻断血流时限与神经功能缺损及脊髓病理变化关系十分密切在血流阻断 1min 后，几乎全部动物均表现截瘫阻断因素去除后，动物可表现多样统计资料表明, 阻断 血流20.6min 可以造成 50%的动物部分神经功能缺损或进展神经功能损害阻断 33.2min 可造成90%动物持久性不可逆神经功能损害,其中 50%动物为迅速持久完全性截瘫; 阻断 52min 可造成 99%动物迅速不可逆性完全性截瘫。
阻断时间 少于 20.6min 通常会引起暂时可逆性神经功能缺损， 阻断血流 25-30min，动物神经功能缺损常为进展性其中实验动物种类的选择同样重要大鼠是值得选择的一种，因为其适用于单克隆抗体、原位杂交反应物、转基因、基因“失效”和其它基因工程，以及电生理研究因此可能成为主要的确定种类新的模型可以在分子和细胞水平接受检验这种模型要求能检查：a.损伤脊髓的水肿情况；b.炎症和免疫细胞介导的组织自损；c.白细胞粘附和浸润 ;d.Cytokine-NTF系列和它们间相互作用;e.神经学和神经生理学作用1.2.3 脊髓缺血再灌注研究观察方法脊髓缺血再灌注研究观察方法 50 年代 Tarlov[13]在进行脊髓损伤的实验研究中 ,首先提出了分级评定脊髓功能的神经学标准 以后很多研究者在对脊髓损伤平面以下的躯体自主运动功能进行评定时，大都运用了 Tarlov 的分级方法或其改良方法 如 Tator[14]在对猴运动功能进行评定时,采用的改良 Tarlor 法为:0级,肢体完全瘫痪;1 级,肢体或划动;2 级, 所有关节能良好运动,但不能走动和负重;3 级;可能行走和负重; 但不稳;4 级:正常。
但 Taror 认为 Tarlov 的这种应用双盲试验。