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1、水产生物综合实验指导尹 玲 刘 群 编著日照职业技术学院水产系1第一部分 基础实验实验 1 显微镜的结构和使用一、目的与内容（一）目的：初步了解显微镜的基本构造，能够规范和较熟练地使用。（二）内容：1、显微镜的各部分构造，并理解其基本性能。2、通过观察装片，掌握显微镜的使用方法。二、材料与用品1、材料生物玻片标本。2、用品显微镜、擦镜纸。三、操作与观察（一）显微镜的构造普通光学显微镜是由机械系统、光学系统及光源系统 3 部分组成。此处以介绍双筒显微镜为主（图 11） 。图 11 光学显微镜的构造21机械系统主要对光学系统和光源系统起支持和调节作用。它包括：（1）镜座与镜柱 镜座是显微镜底部的承
2、重部分，可降低显微镜重心，使之不致倾倒。其后方有一直立的短柱称为镜柱，它支持着镜台。（2）镜臂与镜筒 镜臂是镜柱以上的一个斜柄，便于手把握。镜臂的顶端安装有镜筒和镜头转换器。镜筒是镜臂前端的两个圆筒，其内安装目镜镜头。由物镜到目镜的光线便由此通过。调节左右镜筒之间的水平距离，以适应观察者两眼的眼间距，可使左右目镜的视野完全重合。（3）镜台与标本移动器 镜台亦称载物台，是放置玻片标本的平台。其中央有一圆孔，称通光孔，来自下方的光线可由此进入物镜。镜台上装有标本移动器（或称推进尺） ，标本移动器上的压片夹用以固定载玻片，镜台右下方有标本移动器调节螺旋，转动螺旋可前后左右移动玻片标本。标本移动器上还
3、带有标尺，可利用标尺上的刻度寻找和记录所观察标本的位置。（4）镜头转换器 是镜筒下端一个可旋转的圆盘，其上可装置数个物镜镜头，转动转换器可换用不同倍数的物镜。（5）调焦螺旋 位于镜柱的左右两侧，有粗、细两个调焦螺旋，能使镜台升降，以调节物镜与所观察标本之间的距离，获得清晰的图像。粗、细调焦螺旋组合在一起，外周粗的螺旋为粗调焦螺旋，其升降距离较大，主要用于寻找目的物。用低倍镜观察标本时，用粗调焦螺旋调焦距。粗调焦螺旋中央、周径较小的是细调焦螺旋，其升降距离较小，能精确地对准焦点，获得更清晰的物像。2光学系统亦即成像系统，分别由目镜和物镜构成。（1）目镜 安装在镜筒上端，其结构是在一个金属圆筒上端
4、装有一块较小的透镜、下端内侧装有一块较大的透镜，其作用是将物镜所放大了的物像进行再放大。每台显微镜常备有几个倍数不同的目镜，每个目镜上分别标有 5、10、12.5等放大倍数。（2）物镜 由数组透镜组成，可放大物体。透镜的直径越小，放大的倍数越高，每台显微镜均备有几个倍数不同的物镜，放大 40以下的为低倍镜，一般有4、10；放大 40以上的为高倍镜，放大 100以上的为油镜。如何计算显微镜的放大倍数？物镜是显微镜获得物像的主要部件，其作用为聚集来自光源的光线和利用入射光对被观察的物体做第一次放大。3光源系统由光源、聚光器和可变光阑构成。（1）内光源或反光镜 在通光孔正下方的镜座上有一个内置式电光
5、源，镜座的后3侧有电源开关，左侧或右侧有光量调节器，用以调节光线的强弱。旧式显微镜采用外光源，在镜台孔正下方的镜座上有一反光镜，它为一圆形的平、凹双面镜，接受外来光线并将光线反射到聚光器。平面镜反光较弱，用于光线较强的情况；凹面镜反光较强，用于光线较弱的情况。反光镜的方向可以任意转动调节，以选择适合的角度收集来自任何方向的光线。（2）聚光器 在通光孔下方，由 23 块凸透镜组成。作用是聚集来自下方的光线，使光线增强，通过通光孔射入标本上，并使整个物镜的视野均匀受光，以提高物镜的分辨力。（3）可变光阑 位于聚光器下面，由许多金属片组成。推动操纵光圈的调节杆，就可调节光圈的大小，使上行的光线强弱适
6、宜，便于观察。（二）显微镜的使用方法（1）安放显微镜 打开镜箱，右手紧握镜臂，左手平托镜座，轻放桌上距离桌子边缘几厘米处，让目镜对着观察者。（2）检查 检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。（3）对光 配置内置式电光源的显微镜可直接打开电源开关，并调节光量，使视野内的亮度达到明暗适宜，同时打开光圈。旧式显微镜应首先将可变光阑的孔径调至最大，将聚光器升至最高点，再将低倍镜对准通光孔，镜头离载物台约 1cm。这时，把反光镜转向光源，直到视野中的光线既明亮又均匀时为止。在镜检全过程中，根据所需光线的强弱，还可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器加以调节。（4）调焦 光线对好后，将玻片标本放在镜台上，有盖
7、玻片的一面朝上，被检物体对准镜台孔正中，用标本移动器上的压片夹卡紧，然后调焦。转动粗调焦螺旋调节镜台与物镜间的距离，从侧面注视，以二者间距离 5mm 为度。然后自目镜观察，慢慢转动粗调焦螺旋，同时移动标本移动器，直到基本看清标本物像。（5）低倍镜观察 用粗调焦螺旋调焦后，再轻轻转动细调焦螺旋，以便得到清晰的物像。如果观察的目标不在视野中央，可调节标本移动器，使之恰好位于视野中央。玻片移动方向与物像移动方向的关系如何？若光线不适，可拨动可变光阑的操纵杆，调节光线至适宜。（6）高倍镜观察 在低倍镜下将欲详细观察的标本部分移至视野中央，再转动镜头转换器，将高倍物镜转至工作位置。适当调节亮度后，只需微
8、微转动细调焦螺旋，就可看到更清晰的物像。此时能使用粗调焦螺旋吗？为什么？由于显微镜下观察的被检物有一定厚度，故在观察过程中必须随时转动细调焦螺旋，以了解被检物不同光学平面的情况。在高倍镜下，将玻片中的被检物按从上到下、从左到右的顺序移动、观察一遍，再4由低倍镜转高倍镜反复观察几次，以熟练高倍镜的使用。用高倍镜观察后，若有必要，可再换用油镜观察。（7）油镜观察 转动粗调焦螺旋，使物镜与镜台保持一定距离。滴 1 滴香柏油于玻片标本待观察的区域上，将油镜头转至工作位置，眼睛从侧面注视，转动粗调焦螺旋，直至油镜头浸没于香柏油内，几乎与载玻片相接触，但不能相碰。然后从目镜中观察，用粗调焦螺旋极其缓慢地向
9、上调节至出现物像为止，注意勿将粗调焦螺旋转动方向搞反了，以免油镜头与载玻片相碰而损坏了镜头及玻片。再用细调焦螺旋调至物像清晰，此时还应适当增加光的亮度。如果镜头已提出香柏油而尚未见到物像时，应按上述过程重复操作。使用完毕，将镜头从香柏油中脱离，取下玻片，用擦镜纸擦去镜头和玻片上的香柏油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头上的油迹，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。二甲苯用量不宜过多，擦试时间应短。切忌用手或其他纸擦试镜头，以免损坏透镜。（8）复原 显微镜使用完毕，关闭电源，将物镜镜头转开，取下玻片。擦净载物台和物镜，将各部分还原，注意物镜头不可正对通光孔，装镜入箱。四、作业与思考1总结使用显
10、微镜应特别注意的几个问题。2总结自己第一次使用显微镜的优缺点。3由低倍镜转到高倍镜应注意哪些问题。5实验 2 细胞的制片与观察和细胞大小的测量一、目的与内容（一）目的1学习动物细胞标本的涂片制作法和了解动物细胞的基本结构。2学习并掌握测量细胞大小的基本方法。（二）内容1制备口腔粘膜细胞标本、观察细胞形态结构及线粒体的活性染色显示。2细胞中 DNA 和 RNA 的显示。3利用显微镜测微技术测量大鼠肝细胞及其细胞核直径。二、材料与用品（一）材料人口腔粘膜细胞、大鼠。（二）用品显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、无菌牙签、解剖器具、染色缸、染色架、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。0.9生理盐水、0.1 m
11、olL 碘液、0.02詹纳斯绿 B、醋酸洋红染液、甲基绿-派洛宁染液、卡诺氏固定液、丙酮、二甲苯、中性树胶、蒸馏水、水。三、操作与观察（一）人口腔粘膜上皮细胞的制备与观察1滴 1 滴 0.9生理盐水于载玻片中央，用无菌牙签粗的一端轻轻地在口腔颊部刮几下，将刮下的白色粘性物质放入载玻片上的滴液内，轻轻涂抹使分散均匀；用镊子夹住一块洁净的盖玻片的一边，使另一边与载玻片上的滴液边缘接触，然后缓慢放下，防止产生气泡，用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余的液体。2置低倍镜下寻找轮廓较清楚的单个细胞并移至视野中央，再转高倍镜观察。可见口腔粘膜上皮细胞呈扁平多边形或扁圆形，仔细辨认细胞核、细胞质和细胞膜等基本结构。
12、观察时光线应暗些。为什么？3如细胞结构观察不够清楚，可在盖玻片一侧滴 1 滴 0.1 molL 碘液（也可采用0.1亚甲基蓝或 0.1中性红染液） ，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，使碘液通过细胞进行染色，再置显微镜下观察，细胞质染成浅黄色，而细胞核染成深黄色。 6（二）口腔粘膜细胞活体染色显示线粒体将从口腔粘膜刮下的白色粘性物薄而均匀地涂在载玻片上，加一滴 0.02詹纳斯绿B 染液，染色 20min，盖上盖玻片，置显微镜下观察，高倍镜下可见细胞质无色，在细胞质中散在一些蓝绿色短杆状和圆形颗粒，即为线粒体。如果整个细胞全为蓝色，说明什么?1取材 用手捏住大鼠的头部，剪断其颈部动脉，放血致死。用自来
13、水冲洗大鼠颈部血迹和腹部，于蜡盘中用大头针固定四肢，打开腹腔，迅速取出肝脏，剪成12mm 厚的小块（注意安全，此步骤由教师完成） 。2涂片 取一小块肝脏，在一干净的载玻片中央涂抹数下。3固定 浸入卡诺氏固定液中固定 510min。4染色 将涂片平放在染色架上，在标本上滴数滴甲基绿派洛宁染液，染色20min。5水洗和分色 用蒸馏水缓缓冲去玻片上多余的染液，并用吸水纸吸去多余水分，但不可吸得过干，再用丙酮滴在标本上分色 30s，随后放入丙酮二甲苯（1：1）溶液中浸泡片刻。6透明和封片 将涂片放入二甲苯中 10min，取出，滴 1 滴中性树胶，盖上盖玻片（方法同前） 。7观察 置显微镜下观察，其中含
14、 RNA 区域被染成红色，而含 DNA 区域被染成蓝绿色或淡绿色，注意 RNA、DNA 在细胞中的分布区域。（三）细胞大小的测量1显微测微尺及其使用方法 （1）显微测微尺由镜台测微尺（台尺）和目镜测微尺（目尺）组成。台尺是一特制的载玻片，其中央具有精确刻度的标尺，专门用于校正目尺每格长度，标尺全长 1 mm，等分为 10 大格，每大格再等分为 10 小格，所以每小格长 0.01 mm，即 10pm。亦有全长为，2 mm，共等分为 200 小格，每小格长度不变。目尺是一个可以放入目镜内的特制圆形玻片，在中央刻有不同形式的标尺，多为直线式，长 5mm，等分为 5 大格、50小格。目尺每格测量的实际
15、长度因不同物镜的放大倍数和不同显微镜镜筒长度的差异而有所不同，因此在使用前需用台尺校正。（2）目尺的校正（标定）自镜筒中取下一枚目镜，卸下目镜上的透镜，将目尺装入目镜的光阑板上，有刻度的一面向下，再将目镜上的透镜旋上，并将目镜放回镜筒。将台尺置于载物台上，有刻度的一面朝上。 在低倍镜下将台尺(标尺外围有一小黑环)移至视野中央，然后换用测量时所用放7大倍数的物镜，调焦，使标尺上的刻度清晰可见。转动目镜，使目尺的刻度与台尺的刻度平行，再移动标本移动器，使目尺的零线与台尺某段的刻度线相重合，然后找出两尺的第 2 条重合线（图 21） ，准确读出并记录两重合线之间目尺和台尺各有多少格。计算目尺每小格所
16、测量的镜台上物体的实际长度。目尺每小格实际测量长度（m）（2 条重合线间台尺的格数10）/2 条重合线间目尺的格数。如果换用不同倍数的目镜或物镜，此数据能否采用？为什么？（3）细胞体积、核体积和核质比的计算公式： 图 2-1 用镜台测微尺校正目镜测微尺椭圆形 V (a、b 为长、短半径）2 34ab圆球形 V （R 为半径）3 34R核质比 NPVn(VcVn） （Vn为核的体积，Vc为细胞的体积）2大鼠肝细胞大小的测定（1）染色 取一涂有肝细胞的载玻片，浸入卡诺氏固定液中固定 510min 滴 1 滴醋酸洋红染液，盖上盖玻片，置显微镜下观察，细胞核呈鲜红色，细胞质呈浅红色。（2）测量 目尺校正好后，移去台尺，换上已染色的肝细胞涂片，随机挑选 20 个形态较规则的细胞用目尺测量其占几小格，再乘以目尺每小格实际测量长度，即为细胞直径。同法测量相应细胞的细
