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1、1登革 2 型病毒 E 基因克隆及 B 细胞抗原 表位分析作者：贡树基 周浩 陈丽丹 梁冰锋 【摘要】 目的 扩增登革病毒 2 型新几内亚株（NGC）E 基因，并进行 B 细胞抗原表位分析。方法 根据登革 2 型病毒 NGC 株 E 基因序列设计引物，采用 RT PCR 技术扩增 NGC 株 E 基因并克隆至 pGEM T 载体，转化大肠杆菌 DH5 后测序。按Kyte Doolittle 方案、Jameson Wolf 方案和 Emini 方案预测 B 细胞抗原表位。结果 通过 RT PCR 方法，获得了登革 2 型病毒 NGC 株 E 基因，并对登革 2 型病毒 NGC 株 E 基因进行
2、B 细胞抗原表位预测。结论 通过 RT PCR 方法，获得了登革 2 型病毒 NGC 株 E 基因，为制备登革 2 型病毒 E 基因单克隆抗体和疫苗打下基础。 【关键词】 登革病毒； E 基因； B 细胞抗原表位【Abstract】 Objective To amplify the E gene of dengue 2 virus NGC and analyze the B cell epitope of E protein. Methods According to the sequences of NGC E gene,a pair of primers were designed for
3、 the amplification of the E gene fragment from the isolate of dengue 2 virus NGC with RT PCR. The amplified E fragment was cloned into vetor pGEM T and sequenced. The B cell epitope of E protein of dengue 2 virus NGC was analyzed by Kyte Doolittle method、Jameson Wolf method and Emini method. Results
4、 The 1 485 bp length E gene of dengue 2 virus was amplified successfully by the RT PCR. The B cell epitope of dengue 2 virus was predicted. Conclusion The E gene of dengue 2 virus was successfully amplified by the RT PCRAnd it will be advantageous for monoclonal antibody and vaccine preparation of E
5、 gene of dengue 2 virus.【Key words】 Dengue virus； E gene； B cell epitope2登革病毒（dengue virus，DEN）属黄病毒科黄病毒属，基因组为单股正链RNA，全长约 11 kb，包括 5和 3非编码区及一个开放阅读框。DEN 共有 4 个血清型，均可引起登革热（DF）、登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS），通常登革 2 型病毒（DEN2）的感染较其他血清型更为严重1 4。大量研究表明，E 蛋白作为登革病毒重要的抗原蛋白，它不仅是登革病毒主要的毒力蛋白，而且还带有型特异、属特异抗原决定簇。E 蛋白存在诱导中和抗
6、体及血凝作用有关的抗体表位，它能诱导宿主产生保护性的中和抗体，又能诱导产生血凝抑制抗体，可引起宿主保护性免疫反应，此外还与 DHF 和 DSS 的致病机制有关。同时，E 蛋白在毒粒侵染细胞过程中起重要作用，E 蛋白上可能具有某些宿主细胞表面受体结合的配体。因此，获得高纯度的 E 蛋白为制备登革病毒高效、特异的单克隆抗体和研究宿主细胞上登革病毒受体有重要意义，还为进一步探讨DHF、DSS 的致病机制提供坚实的基础。本研究通过 RT PCR 方法，构建了登革2 型病毒新几内亚株(NGC)E 基因的克隆载体，并对其 E 蛋白进行 B 细胞抗原表位分析，为制备登革 2 型病毒 E 基因单克隆抗体和疫苗
7、奠定了基础。1 材料与方法1.1 病毒 RNA 制备 登革 2 型病毒 NGC 株经鼠脑内接种传代后，取 1/2 发病鼠脑，用 Trizol（美国 Invitrogen 公司）提取总 RNA，于-70保存备用。1.2 PCR 引物设计 根据登革 2 型病毒 NGC 株基因组全序列（GenBank Access Number：AF 038403）用 Primer 软件设计引物，PCR 引物序列及位置：P1 引物：5 atgcgttgcataggaatatcaaata 3，位于其基因组的 937 处；P2 引物：35 ggcctgcaccataactcccaaatac 3，位于其基因组的 2 42
8、2 处。扩增片段长度为 1 485 bp。1.3 反转录合成 cDNA 取 15 l 总 RNA，加入 1 l 10 molL 反向引物，95作用 3 min，随后置冰浴中 1 min，再加入 5 l 5缓冲液、1 l 二硫代苏糖醇（DTT）、1 l RNA 酶抑制剂、2 l SuperScript llI 逆转录酶（美国 Invitrogen 公司）、1 l 10 molL dNTPs，最后加焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水至总体积 30 l，55保温 3 h 进行反转录，反应完毕，70灭活 15 min。逆转录产物中加入 1 l 重组RNase H，37 温育 20 min，去除 cDNA
9、中混合的 RNA。1.4 PCR 反应条件 利用 La Taq 酶（日本 TaKaRa 公司）进行 PCR 反应，最终采用 30 l 反应体系：2 l 模板 DNA（250 ngl）、3 l 10缓冲液（Mg2 25 mmolL）、0.5 l dNTP（50 mmolL）、1 l La Taq 酶（5 Ul）、上下游引物各 1 l（10 molL）、水 21.5 l。反应条件：94 2 min，94 15 s，60 1 min，72 2 min，扩增 30 个循环；最后 72 延伸 7 min。PCR 产物使用 0.7琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段大小。1.5 PCR 产物的纯化 使用 DNA 纯
10、化试剂盒（日本 TaKaRa 公司）纯化 DEN2 E 基因预期长度的 PCR 产物。-20保存备用。1.6 PCR 产物与 pGEM T 载体连接 将回收产物与 pGEM T 载体（Promega公司）连接，4放置 12 h。将重组载体转化 DH5 感受态细胞，于含氨苄青霉素的固体 LB 培养基 37培养 16 h，利用 X Gal 和 IPTG 筛选阳性克隆。获得的阳性克隆菌分别经 PCR 和双酶切初步鉴定，送 TaKaRa 公司测序。1.7 序列分析 采用 DNAman 软件对测序结果与登革 2 型病毒 NGC 株 E 基因4核苷酸序列进行同源性比较。运用 DNAstar 软件分别预测
11、E 蛋白的亲水性肽段、表面可能性肽段和抗原指数的肽段。 2 结果2.1 RT PCR 扩增结果 以提取的总 RNA 为模板，应用 RT PCR 方法扩增获得约 1 485 bp DNA 片段，与预期大小相符，见图 1。图 1 RT PCR 扩增结果（略）M：DNA Marker wide 15 000 1：登革 2 型病毒 E 基因 PCR 扩增产物2.2 E 基因克隆 将上述 PCR 产物纯化回收后，与 pGEM T 载体连接，转化DH5 感受态细胞，利用蓝白斑菌落筛选阳性重组克隆，对阳性质粒（pGEM T E）进行单酶切及双酶切初步鉴定，见图 2。图 2 E 基因克隆及鉴定（略）M：DNA
12、 Marker DL 15 000 1：E 基因连接 pGEM T 载体 2：NotI 单酶切pGEM T E3：NotI 和 SacII 双酶切 pGEM T E2.3 序列测定 测序结果表明，所获得片段与 NGC 株 E 基因核苷酸序列同源性达到 100，证明我们克隆出的是 NGC 株 E 基因。2.4 B 细胞抗原表位分析 运用 Kyte Doolittle 方案、Emini 方案和Jameson Wolf 方案分别预测 E 蛋白的亲水性肽段、表面可能性肽段和抗原指数的肽段，3 个预测指数形成的共同区域均分别位于病毒 E 蛋白 N 端第34 41、48 56、65 80、85 89、12
13、5 128、133 136、144 148、154 161、241 249、289 293、326 330、343 346、361 364 和 470 474 肽段内，见图 3。5图 3 登革 2 型病毒 E 基因 B 细胞抗原表位分析（略）3 讨论目前，关于病毒的检测一般包括病毒分离、核酸杂交法、聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光以及 ELISA 试验等方法5，6。其中，病毒分离及核酸杂交法其操作比较繁琐，对仪器要求较高，而且周期都较长、很难在实践中得到应用；PCR 方法简便、快速，但假阳性、假阴性率较高，且实际操作中存在交叉污染的问题，对人员要求较高，目前临床上一般不主张采用；而免疫荧光、E
14、LISA 等免疫学方法具有操作简便、对仪器要求低的优点，在临床上已得到广泛应用。但对登革病毒，目前国内仍未建立特异性强、稳定性高的特异性检测抗体，目前其检测的假阳性率普遍较高，大大限制了它们的应用，随着分子生物学技术的发展，蛋白体外表达、纯化技术日益成熟，为疫苗的研制及蛋白特性分析提供了新的有力手段。与常规抗原相比，基因工程抗原具有纯度高、成分单一、易于大规模生产等优势，为登革病毒的快速诊断提供了新的手段。在本研究中，我们成功构建出了登革 2 型病毒 E基因的克隆载体，进一步的酶切及测序结果也说明载体构建正确，并对登革 2 型病毒 E 蛋白进行 B 细胞抗原表位分析，为制备登革 2 型病毒 E
15、 基因单克隆抗体和疫苗打下基础。【参考文献】1 Dar A，Munir S，Vishwanathan S，et alTranscriptional analysis of avian embryonic tissues following infection with avian infectious bronchitis virusVirus Res，2005，110（1 2）：41 552 Khatri M，Palmquist JM，Cha RM，et alInfection and activation of bursal macrophages by virulent infectio
16、us bursal disease virusVirus Res，2005，113（1）： 44 5063 Reddy MK，Nair S，Sopory SKGlobal amplification of cDNA from limiting amounts of tissueAn improved method for gene cloning and analysisMol Biotechnol，2002，22（3）：223 2304 Tellier R，Bukh J，Emerson SU，et alLong PCR amplification of large fragments of viral genomes：a technical overviewMethods Mol Biol，2003，226：167 1725 秦鄂德，杨佩英，于曼，等应用通用引物聚合酶链反应技术检测不同型别的登革病毒中华
