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1、1普陀区中心医院例乙型肝炎患者病 毒表面抗原的突变位点的检测作者：马艳春 吴蓉 郁磊 康向东 摘 要目的：检测普陀区中心医院 46 例乙型肝炎病毒（HBV）患者表面抗原(HBsAg)突变情况,并探讨这些突变是否影响HBsAg 的抗原性。方法：从 46 例 HBV 患者的血浆中抽提 DNA，根据 HBsAg 的基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）法，扩增 46 例乙肝病人的 HBsAg基因。琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物； DNA 测序,并与野生型的 HBsAg 的基因比较,发现突变位点。并用国产的诊断试剂盒检测这些突变体。结果：46 例乙肝病人的 HBsAg 基因的扩增产物经电泳鉴定
2、与预期相同。DNA 测序结果表明, 存在基因的突变,其中检测到以前未报道过的突变,为单个碱基替换导致的错义突变；也有部分表现为同义突变，但这些突变体未改变 HBsAg 的抗原性，25 例标本未检测到突变。结论：检测的 46 例 HBV 患者的血浆有 21 例存在突变, 其中 1 例突变是以前未报道过的突变，这些突变不影响抗原性，25 例标本未检测到 HBsAg 基因突变。 关键词乙型肝炎病毒；乙型肝炎病毒表面抗原； 突变 Abstract Objective：To investigate the mutation of hepatitis B virus surface antigen of
3、46 patients in Putuo Hospital. Methods：the genomic DNA of 46 patients was prepared for amplification of hepatitis B virus surface antigen gene. the amplified hepatitis B virus surface antigen gene was separated by agrose gel for direct sequencing.Results：Different mutation sites were found in hepati
4、tis B virus surface antigen gene including missense mutation and nosense mutation, some of which were first discovered. However all such mutations did not change the antigencity. No mutation was found in 25 patients. Conclusion：21 patients were found to have mutations in hepatitis B virus surface an
5、tigen gene and 25 patients did not have any mutation. One mutation was first reported, and none of mutations changed the antigencity. 2Key wordsHepatitis B virus；surface antigen；DNA mutation 世界卫生组织(WHO)报道，超过 20 亿的人曾经感染过乙肝病毒(HBV)，其中有 35 亿是慢性持续感染，每年超过 100 万的慢性乙肝携带者死于肝硬化或肝癌1。HBV 是一种双链环状 DNA 病毒2 ，DNA 长度
6、约为 32 kb，其复制是通过逆转录酶进行的3，逆转录酶缺乏一定的校正能力，在特异性选择压力下，导致基因序列发生改变，包括碱基的替换、插入和缺失等，这些选择压力包括免疫制剂和核苷类药物等，它能够抑制野生型 HBsAg 至不可检测的水平。HBV 表面抗原(HBsAg)是诊断 HBV 感染最重要也是最常用的标志物， “a”决定簇的基因区的突变导致其 HBsAg 不能被一些市售诊断试剂盒中的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体识别4。本研究检测普陀区中心医院 46 例乙型肝炎病毒（HBV）患者表面抗原(HBsAg)突变情况,并探讨这些突变是否影响 HBsAg 的抗原性。 1 材料和方法 1.1 研究对象
7、 2008 年 4 月 25 日至 2008 年 6 月 4 日我院肝炎门诊收治的 30 例乙型肝炎患者并经荧光定量 PCR 检测，DNA 拷贝数大于 106 。 1.2 主要试剂 DNA 浓缩液和提取液由中山大学达安基因股份有限公司提供，pfu 酶buffer，dNTP 等 PCR 反应试剂购自上海天根生物有限公司，琼脂糖胶购自上海申能博彩生物科技有限公司，乙肝诊断试剂盒购自上海科华生物。 1.3PCR 引物的设计 根据 HBsAg 基因编码区的理论序列设计并由上海生工生物有限公司合成了一套扩增乙肝病毒表面抗原基因的引物即： 3S1: 5-aaGGATCCatggagagcacaacatca
8、ggattcctagg-3 S2: 5- ggctcgagTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGTAATAGAGG-3 1.446 例 HBV 患者血浆 DNA 的抽提 应用静脉采血法采集病人的静脉血液 2ml，离心取上层血清； -20 冷冻保存, 备用。取 100 ul 血清加入等量 DNA 浓缩液，振荡器振荡混匀 5 秒； 12000 rpm 离心 10 分钟；去上清，沉淀中加入 30 ul DNA 提取液，振荡器剧烈振荡混匀510 秒，瞬时离心数秒，100恒温处理 10 分钟；12000 rpm 离心 5 分钟，备用。 1.5HBsAg 基因 PCR 产物的扩
9、增及测序 以所制备的 DNA 为模板,用 S1 和 S2 引物扩增 HBsAg 基因。扩增体系为50L，扩增条件为:94预变性 3min，94变性 30s，60退火 40s，72延伸 45s，共 32 个循环，最后于 72再延伸 10min。PCR 产物用 10g/L 的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。所获阳性 PCR 片段由上海生物工程有限公司测序。 1.6HBsAg 基因突变样本的 ELISA 检测 取血清 100L，用酶联免疫吸附法( ELISA) 检测 HBsAg,。所有操作严格按试剂使用说明书进行。 2 结果 2.1HBsAg 基因 PCR 产物的扩增 以抽提的 DNA 为模板,用 S1 和
10、 S2 引物扩增 HBsAg 基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,出现的 70Obp 左右条带分别为 HBsAg 基因片段，见图 1。 2.246 例 HBsAg 基因 PCR 产物的序列测定及分析 46 例 HBsAg 基因 PCR 片段送上海生物工程有限公司测序。经分析发现以下4突变， （见表 1）。 2.3HBsAg 基因突变样本的 ELISA 检测， 突变样本 ELISA 检测结果均为阳性，结果（见表 2） 3 讨论 S 基因位于 HBV 核苷酸第 155833 位，编码 226 个氨基酸的 HBV 外膜主蛋白，即 HBsAg，它是引起机体产生保护性免疫的主要成分。HBsAg 有个优势
11、共同抗原表位称?a决定簇，位于高度保守的 124147 位氨基酸亲水区，并以 124 和127、139 和 147 问的双硫键形成双襻样结构，维持 HBsAg 的抗原性，期间几个甚至单个氨基酸的变异就足以改变其抗原性5。 “a”决定簇的基因区的突变导致其HBsAg 不能被一些市售诊断试剂盒中的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体识别，因此提 HBsAg 试剂盒的临床灵敏度和突变体的识别能力是必要的。HBV 突变体的监测是 HBsAg 检测的一大挑战。目前 HBsAg 突变体的种类很多，常见的点突变有 G145R，T126S，Q129H，M133L，T143L，D144A，T126S + G145R
12、， P142L + G145R， P142S + G145R，D144A+G145R 等6 。 本研究通过对我院 46 例乙肝病人表面抗原基因序列的扩增，检测表面抗原基因的突变情况，检测的 46 例HBV 患者的血浆有 21 例存在突变, 其中 1 例突变是以前未报道过的突变，这些突变不影响抗原性，25 例标本未检测到 HBsAg 基因突变。 参考文献 1SchochetmanG，KuhnsMCHIV variantsand hepatitis B surface antigen mutants：diagnostic challenges for immunoass-aysJJ Med Vir
13、ol，2006，78(Suppl 1)： s3-6. 2 Mangold CM，Streeck REMutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis B virus small enelope proteinJJ Virol，1993，67 (8)：4588-4597. 3Minami M，Okanoue T，Nakima E，et a1Significance ofPre-S re-gion- defective hepatitis B viru s that emceed during exacerbation fo
14、r chronic type B 5hepatitisJHepatology，1993，17(4)：558-563. 4J olivet-Reynaud C，Lsenchal M，Odonnell B，et a1Localization of hepatitis B surface antigen epitopes present on variants and specifically recognised by anti- hepatitis B surface antigen m0nocl0nal antibodiesJ，JMed Virol，2001，65(2)：241- 249. 5Paul FDetectiong hepatitis B surface antigen mutantsJEmerg InfectDis，2006，12(2)：198-203. 6Ni F，Fang D，Gan R，et a1A new immune escape mutt of hepatitis B virus with an Asp to Ala substitution in aa144 of the envelop major proteinJRes Virol，1995，146(6)：397-407.
