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1、1SHP1 表达与慢性粒细胞白血病进展的初 步研究【摘要】 目的： 探讨 SHP1 表达与 CML 急变的关系；构建 SHP1 真核表达载体. 方法： 应用 RTPCR 比较慢性期和急变期 CML 患者原代细胞中 SHP1 的mRNA 转录本水平；SHP1 真核表达载体 pcDNA3.0SHP1 的测序，检测其 mRNA和蛋白表达. 结果： 急变期患者 SHP1 转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异；pcDNA3.0SHP1 转染 K562 细胞，可表达 SHP1 mRNA 和蛋白. 结论： SHP1 的表达下调可能与 CML 由慢性期朝加速/急变期演化过程有关；成功构建了 SHP1
2、 真核表达载体 pcDNA3.0SHP1. 【关键词】 白血病 髓样 进展期 SHP10 引言慢性髓系白血病（chronic myeloid leukaemia, CML）是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，近 90的患者肿瘤细胞中可以检测到 BcrAbl 融合基因，该基因催化自身和一系列底物的酪氨酸残基（tyrosine residue，Tyr）发生过度磷酸化，导致多个信号传导通路的异常激活，最终导致 CML 的发生. SHP1 是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族的重要成员，能够通过催化受体Tyr 残基“去磷酸化”抑制信号传导.
3、我们应用 RTPCR 比较了慢性期和急变期CML 患者原代细胞中 SHP1 的 mRNA 转录本水平，并克隆 SHP1 全长 cDNA 序列，构建真核表达载体，以用于进一步研究 SHP1 在 CML 发病及进展中的潜在作用.21 对象和方法1.1 对象 CML 患者 11（男 6，女 5）例，中位年龄 28 岁. 患者骨髓单个核细胞经按 G 显带制备染色体及核型分析和/或间期荧光原位杂交检测发现有 Ph 染色体和或/BcrAbl 融合基因（表 1），临床诊断慢性期 7 例，急性期 4 例. 正常对照选择骨髓未受浸润的恶性淋巴瘤患者 3 例. 均抽取无菌肝素抗凝骨髓 35 mL，Ficoll 分
4、离单个核细胞，预冷 PBS（pH=7.4）洗涤细胞 2 遍备用. HEL 细胞和K562 细胞购自上海细胞生物研究所；RPMI1640 培养基为 Gibco 产品；胎牛血清为杭州四季青产品；MMLV 逆转录酶和 Taq 酶为 Promegar 产品；总 RNA 提取试剂和 Oligo(dt)15 购自上海博彩公司；抗 SHP1 多克隆抗体购自 BD Transduction Laboratories 公司；RIPA 细胞裂解液和低分子量蛋白 Marker 购自上海申博生物公司；人红白血病细胞 HEL 和 CML 急变 K562 细胞在含 100 mL/L 胎牛血清的PRMI1640 培养液中，
5、于 37，50 mL/L CO2，饱和湿度的培养箱中培养, 每2436 h 传代 1 次, 取对数生长期细胞进行实验.表 111 名 CML 患者的临床资料序1.2 方法1.2.1CML 患者 SHP1 mRNA 的表达 SHP1 上游引物：5ACATTCTCCCCTTTGACC 3，下游引物：5CTCAGGTACTGGTAATGCC 3，扩增产物 414 bp1. 细胞中甘油醛 3磷酸脱氢酶（GAPDH） cDNA 的水平也被检测作为内对照，GAPDH 上游引物：5AATCCCATCACCATCTTCCA 3，下游引物：5CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3，扩增产物 590 bp.
6、 实验组和对照组细胞同时各取 5106，Trizol 提取总 RNA. 反转录体系 25 L，包括 RNA 2 g，引物Oligo(dt)15 0.5 g，RNasin 500 nkat，4 种 dNTP 浓度各为 500 mol/L，MMLV 逆3转录酶 3334 nkat，42反转录 1 h，95 5 min 结束反应. PCR 反应体系为 20 L，包括反转录产物 2 L，寡核苷酸引物各 20 pmol，4 种 dNTP 浓度各为 200 mol/L，Taq 酶 6.7 nkat. 扩增条件：94 45 s，54 45 s，72 60 s，循环 29 次，72 10 min 结束反应.
7、扩增产物在 10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行吸光度分析，视频打印结果.1.2.2RTPCR 克隆 SHP1 基因全长 cDNA 序列上游引物：5ATAAGCTT Hind GATGGTGAGGTGGTTTC 3；下游引物：5GCCACCTGAGGACAGCTTAAG EcoRIAT 3. 在上游引物 5末端引入 Hind酶切位点, 在下游引物 3末端引入EcoRI 酶切位点. 取 1107 个 HEL 细胞，Trizol 提取总 RNA. PCR 反应体系为 25 L，包括反转录产物 3 L，寡核苷酸引物各 20 pmol，4 种 dNTP 浓度各为 200 m
8、ol/L，Taq 酶 6.7 nkat. 扩增条件：95 45 s，65 45 s，72 60 s，循环 32 次，72 10 min 结束反应. 取 PCR 产物 10 L，于 10 g/L 琼脂糖电泳，70 V 恒压电泳60 min 后于凝胶图像光密度分析仪下观察并记录图像，视频打印结果.1.2.3 真核表达载体的构建及鉴定 PCR 产物与真核载体 pcDNA3.0 同时用Hind与 EcoRI 作双酶切,胶回收试剂盒加收酶切片段, 用 T4 链接酶于 16连接过夜. 反应体系为 10 L，包括 SHP1 4 L，pcDNA3.0 2 L，T4 连接酶 50 nkat. 反转录条件：42
9、60min，99 5 min. 取所有连接产物转化感受态 JM109 细菌，涂LBAmp 的平板，1214 h 后挑取单个菌落，经扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，酶切分析鉴定是否有片段插入及大小是否正确，将酶切分析正确的质粒定义为 pcDNA3SHP1. 酶切分析正确的 pcDNA3SHP1 质粒送上海申友生物公司. 测序结果于 NCBI 网站用 BLAST 软件进行序列比较分析，确认克隆的 SHP1 基因序列正确后，将原克隆细胞进行中等量扩增，按聚乙二醇沉淀法中量抽提和纯4化质粒. 取等量 K562，pcDNA3SHP1 及 pcDNA3.0 转基因后的 K562 细胞总蛋白提取物，加入等体
10、积 2电泳上样缓冲液，100加热 5 min，高速离心 10 s；样品及蛋白分子质量标准各 25 g 于 100 g/L SDSPAGE 胶上 150 V 恒压电泳 23 h；考马斯亮蓝染色 23 h；考马斯亮蓝染色脱色液脱色后参考蛋白分子质量标准切胶. 按 Protein Detector Western Blot Kid BCIP/NBT 试剂盒操作说明进行硝酸纤维素膜电转膜、1Detector Block 液进行膜封闭、一抗孵育 1 h，1Wash Solution洗膜、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG 二抗孵育 1 h，洗膜、BCIP/NBT 磷酸酶底物孵育 1015 min 至显色；将
11、膜浸入水中 23 min 终止反应，空气干燥，在 Adobe Photoshop 软件支持下进行图像扫描存储.2 结果2.1SHP1 mRNA 在 CML 患者单个核细胞中的表达靶基因 PCR 与内参 GAPDH的 PCR 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，以正常人作为对照；凝胶光密度分析仪测量各样本的 SHP1/GAPDH 的 ration 值（图 1）. 比较正常对照组（ration=0.1980.046）与CMLCP 患者（ration=0.1270.047）SHP1/GAPDH 的 RTPCR 产品吸光度 ration值，结果用 2Independent Sample Tests 统计法进
12、行检验，发现两组间 SHP1 的表达无差异（P=0.087）；但 CMLBC 组（ration=0.0540.011）与正常对照比较，SHP1 mRNA 水平下调，存在统计学差异（P=0.034）.A: 半定量 RTPCR; B: SHP1/GAPDH 条带强度的吸光度分析. 17: 慢性期患者; 811: 急变期患者; M: marker. 图 1 慢性粒细胞患儿骨髓单个核细胞 SHP1 mRNA 表达2.2RTPCR 克隆全长 SHP1 基因按 RTPCR 法克隆的 PCR 产物于 10 g/L 琼脂5糖凝胶电泳分析，可见一阳性条带，位于 2 kb 片段附近，与 SHP1 的 cDNA 读
13、码框长度相近.2.3SHP1 基因及载体的酶切与测序鉴定克隆的 SHP1 基因成功地定向克隆入真核表达载体 pcDNA3.0 内，酶切分析正确，测序正确. 建立的载体定义为pcDNA3SHP1.2.4pcDNA3.0SHP1 真核载体表达产物 Westen Blot 检测结果显示，pcDNA3SHP1 转基因后的 K562 细 SHP1 蛋白表达阳性，对照组 K562 及pcDNA3.0 转基因的 K562 细胞未见 SHP1 蛋白表达（图 2）.1: K562 细胞; 2: pcDNA3.0 转染的 K562 细胞; 3: pcDNA3SHP1 转染的 K562细胞; M: marker.图
14、 2SHP1 表达的 Western Blot 分析3 讨论SHP1 是 PTP 家族重要成员，几乎表达于所有的造血细胞系中，它通过与 PTK成员结合或使其底物的 Tyr 残基去磷酸化而拮抗 PTK 在多个生长、分化、凋亡等信号通路中酶活性并对这些通路起负性调控作用，且对具有异常激活 PTK 活性的多个癌蛋白激活的信号通路中也发挥了“抑癌基因”的功能. 对肿瘤分子遗传学的深入研究表明，恶性分子事件导致异常 PTK 活性癌蛋白的产生是肿瘤发生的重要原因，更多的肿瘤在恶性转化所涉及的信号通路中也常有 PTK 成员的参与. 在造血因子受体介导的信号通路中 SHP1 与许多 PTK 关系密切，它可以通
15、过 SH2结构域与 PTK 结合而对信号通路产生负性调节，反过来许多 PTK 成员也可以调6节 SHP1 在胞内的表达程度. 大多数研究认为，SHP1 确实能够拮抗肿瘤中异常激活的 PTK 活性和/或催化信号通路中某一关键的 PTK 去磷酸化失活，从而抑制肿瘤的恶性转化能力1-5. 在对 CML 的研究中，Liedtke 等6发现 SHP1 能与P210BCRABL 结合并负性调节 P210BCRABL/SAPK 通路的信号强度，SHP1转基因在纤维母细胞中可以降低 P210BCRABL 的肿瘤转化作用也得到了证实. 最新一项研究显示，SHP1 在 CML 急性期患者中的表达较慢性期患者明显下
16、降，并且与 DNA 甲基化、突变无关，可能是转录后修饰的结果7. 但是目前对 SHP1在 CML 发病、发展中的作用仍然知之甚少.我们应用 RTPCR 对 11 例 CML 原代细胞中 SHP1 的 mRNA 转录本水平进行了半定量检测. 结果 7 例慢性期患者 SHP1 转录本水平与正常对照无差异，但急变期患者 SHP1 转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异. 结合我们之前的实验结果人 CML 急变细胞株 K562 细胞 SHP1 的失表达现象，提示我们P210BCRABL 与 SHP1 可能存在某种功能上的联系，是否 SHP1 的“沉默”更促进了 P210BCRABL 的功能，使得这急变细胞较慢性期 CML 细胞具有更多的恶性特征如分化受阻、对凋亡更为耐受？或者是由于 CML 由慢性期朝加速/急变期演化过程中，BcrAbl 本身会出现 DNA 剂量倍增（双 P
